馬新壯，周勇兵，王 力

隨著社會的高速發(fā)展，人們的生活質(zhì)量逐步提升，高糖、高脂飲食成分在日常飲食結(jié)構(gòu)中所占比重越來越高，致使一些疾病的發(fā)病率逐年增加，比如高脂血癥、糖尿病等，而不良飲食習(xí)慣，尤其是高糖、高脂飲食模式，是造成慢性腎損傷的一種重要風(fēng)險因素[1]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，長期進(jìn)食含糖和脂肪較高的食物，會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)不同程度的腎損傷[2]。長期高脂飲食會導(dǎo)致機(jī)體脂肪含量增加并產(chǎn)生胰島素抵抗，還會造成腎臟抗氧化能力下降[3]；而長期高糖飲食會導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮功能障礙，誘導(dǎo)腎小球濾過屏障的改變[4]。蘆丁是一種黃酮類化合物，常見于日常生活中經(jīng)常食用的蔬菜和水果中，它是槲皮素的糖酮，具有黃酮醇結(jié)構(gòu)[5]。蘆丁可以通過向氧自由基提供電子來直接清除活性氧，能夠有效防止氧化應(yīng)激的發(fā)生[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)蘆丁具有抗氧化、抗過敏、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多種生物活性。還有研究[8]證明，不同劑量的蘆丁可以改善腎臟組織纖維化的程度。幾項研究也表明，蘆丁具有的降糖、改善氧化應(yīng)激等作用，對糖尿病腎病、缺血/再灌注腎損傷及藥物性腎毒性均具有顯著的腎臟保護(hù)作用[9-11]，但對于蘆丁保護(hù)高糖、高脂飲食造成的腎臟損傷等方面的研究目前仍較少。為了探究蘆丁對高糖、高脂飲食導(dǎo)致的腎臟損害的保護(hù)作用，本研究以高糖、高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠為動物模型，加入蘆丁進(jìn)行干預(yù)保護(hù)，研究蘆丁對高糖、高脂飲食造成的小鼠腎臟損害的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 蘆丁(純度≥98%，C27H30O16，百靈威科技有限公司)，4%多聚甲醛(塞維爾生物科技公司)，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新公司)，DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝有限公司)，Synergy2型酶標(biāo)儀(Biotek，美國)。

1.2 動物分組與實驗處理 SPF級雄性ICR小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)均等分為5組，每組各8只：正常飲食組(normal diet group，ND組)，喂養(yǎng)普通飼料；高脂飲食組(high fat diet group，HFD組)，喂養(yǎng)高脂飼料；高糖飲食組(high sugar diet group，HSD組)，喂養(yǎng)普通飼料+60%葡萄糖溶液；蘆丁保護(hù)高脂飲食組(rutin protection high fat diet group，RHFD組)，喂養(yǎng)高脂飼料+蘆丁飽和水溶液；蘆丁保護(hù)高糖飲食組(rutin protection high sugar diet group，RHSD組)，喂養(yǎng)普通飼料+混合溶液(60%葡萄糖溶液+蘆丁飽和水溶液)；飼養(yǎng)條件為室溫(25±2)℃，空氣相對濕度60%～65%，自然光照，小鼠可自由飲水和攝食。RHFD組和RHSD組所用蘆丁水溶液每天均超聲半小時后使用。每天觀察、每周稱重、記錄。連續(xù)喂養(yǎng)120 d后，將小鼠脫頸處死，取腎臟組織放入4%多聚甲醛進(jìn)行固定。其余組織經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃保存待用。

1.3 生化指標(biāo)檢測 從每組8只小鼠中隨機(jī)取5只小鼠的腎臟組織適量，準(zhǔn)確稱重后加入0.9%氯化鈉溶液制備成10%組織勻漿，離心提取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測腎臟組織中TC、TG和MDA水平，并檢測SOD和GSH-Px活性。

1.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，以5 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，PAS染色，封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化并選取合適視野進(jìn)行拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的體質(zhì)量變化 喂養(yǎng)120 d后，HFD組小鼠終體質(zhì)量高于ND組和RHFD組(P<0.05)，ND組和RHFD組終體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)；喂養(yǎng)120 d后，HSD組小鼠終體質(zhì)量高于ND組和RHSD組(P<0.05)，ND組和RHSD組終體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表1 蘆丁干預(yù)后高脂飲食小鼠的體質(zhì)量比較

表2 蘆丁干預(yù)后高糖飲食小鼠的體質(zhì)量比較

2.2 小鼠腎臟組織中TC、TG含量 ND組、HFD組、RHFD組間以及ND組、HSD組、RHSD組間小鼠腎臟組織中TC、TG含量變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3、4)。

表3 蘆丁干預(yù)后高脂飲食小鼠腎臟中TC、TG含量

2.3 小鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平 腎臟組織SOD活性在ND組、HFD組、RHFD組間以及ND組、HSD組、RHSD組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與ND組比較，HFD組GSH-Px活性下降(P<0.05)，MDA水平上升(P<0.05)；與HFD組比較，RHFD組GSH-Px活性上升(P<0.05)，MDA水平下降(P<0.05)(見表5)。在蘆丁干預(yù)高糖飲食組結(jié)果得出了與高脂飲食類似結(jié)果(見表6)。

表4 蘆丁干預(yù)后高糖飲食小鼠腎臟中TC、TG含量

表5 蘆丁干預(yù)高脂飲食小鼠腎臟SOD、GSH-Px活性和MDA水平

表6 蘆丁干預(yù)高糖飲食小鼠腎臟SOD、GSH-Px活性和MDA水平

2.4 蘆丁對高糖、高脂飲食小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響 小鼠腎臟組織切片HE染色結(jié)果表明，ND組腎臟組織形態(tài)基本正常,與ND組相比，HFD組和HSD組均出現(xiàn)了明顯的結(jié)構(gòu)性損傷。HFD組腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多，腎小球壁層上皮細(xì)胞增生，鮑曼囊壁層增厚，新月體形成，腎小管上皮細(xì)胞增生，腎小管空泡變性。HSD組同樣出現(xiàn)了腎小球壁層上皮細(xì)胞增生，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多，鮑曼囊壁層增厚。RHFD組和RHSD組，腎小球和腎小管出現(xiàn)輕度損傷表現(xiàn)，較HFD組和HSD組相比得到了明顯改善(見圖1)。

小鼠腎臟組織切片PAS染色結(jié)果顯示，ND組基本正常，HFD組和HSD組則出現(xiàn)了腎小球系膜增厚，鮑曼囊壁層增厚，腎小管基膜增厚。而與HFD組和HSD組相比，RHFD組和RHSD組得到了明顯改善(見圖2)。

3 討論

不良的飲食習(xí)慣和生活方式是導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)腎臟損傷的重要環(huán)境因素之一，長期攝入大量含糖、脂肪較高的食物會導(dǎo)致機(jī)體糖、脂質(zhì)代謝紊亂，增加肥胖、糖尿病、高脂血癥、動脈粥樣硬化及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險[12]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，高糖、高脂飲食導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量增加在經(jīng)過蘆丁干預(yù)后出現(xiàn)了明顯的減輕，表明蘆丁具有控制體質(zhì)量增加的作用,但是這種作用可能是由于小鼠進(jìn)食量不同造成的，需要更進(jìn)一步的研究證實。MDA是氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度的生物學(xué)指標(biāo)之一[13]。GSH-Px是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的一種過氧化物分解酶，能夠在氧化應(yīng)激反應(yīng)中保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，GSH-Px的活性能夠反映機(jī)體抗氧化能力水平的高低[14]。高糖、高脂飲食導(dǎo)致小鼠腎臟組織中GSH-Px活性降低，MDA含量升高，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并在蘆丁的保護(hù)作用下出現(xiàn)明顯改善，這和蘆丁的抗氧化生物活性有關(guān)，再次證明蘆丁具有改善氧化應(yīng)激的作用。另外，此次實驗中，腎臟組織中TC和TG的含量以及SOD活性的變化雖有升降趨勢但并無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于造模時間或其他原因造成的。

我們對小鼠腎臟組織進(jìn)行切片，并分別進(jìn)行HE染色和PAS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖、高脂飲食導(dǎo)致腎小球和腎小管出現(xiàn)了不同程度的結(jié)構(gòu)性損傷，而蘆丁保護(hù)干預(yù)后損傷得到明顯的改善。高糖、高脂飲食導(dǎo)致腎臟損傷的原因可能有：(1)高糖、高脂飲食導(dǎo)致糖及脂質(zhì)代謝異常，引起肥胖及脂質(zhì)過量，腎臟中過量的脂質(zhì)會導(dǎo)致所有類型的腎細(xì)胞線粒體出現(xiàn)損傷，而線粒體功能障礙則會導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和死亡，最終導(dǎo)致腎組織出現(xiàn)更加嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)性損傷[15]；(2)高脂飲食導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，活性氧(ROS)生成增多，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，引起系膜增生，腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，造成腎損傷[16]。

蘆丁作為一種黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，具有清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化等作用[17]。研究[18]表明，蘆丁可以有效清除氧自由基，減少高熱量飲食引起的體質(zhì)量增加，具有抗氧化、抗血脂異常的作用。蘆丁對腎臟的保護(hù)作用可能是通過以下途徑實現(xiàn)的：(1)蘆丁抑制脂肪生成，激活脂肪酸的代謝，降低腎臟組織中TC和TG的含量，減少腎臟組織中脂質(zhì)累積，減輕腎細(xì)胞損害，從而保護(hù)腎臟[19-20]；(2)蘆丁具有清除氧自由基，改善氧化應(yīng)激的作用，可以增加抗氧化酶GSH-Px的活性以及減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的含量，減少氧化應(yīng)激對腎臟造成的損害[11]。蘆丁可以通過改善氧化應(yīng)激，降低腎細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，增加SOD和過氧化氫酶活性減輕萬古霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]；此外，研究[22]表明，蘆丁的抗氧化和抗炎作用還可以通過降低氧化應(yīng)激，抑制相互連接的ROS/JNK/TNF/p38 MAPK信號通路，減輕順鉑導(dǎo)致的腎毒性。

本實驗中腎臟損傷的一些實驗結(jié)果不夠全面，但經(jīng)過蘆丁保護(hù)干預(yù)后，高糖、高脂飲食造成的氧化應(yīng)激和腎臟結(jié)構(gòu)性損傷出現(xiàn)了明顯的改善，這證明了蘆丁對高糖、高脂飲食造成的腎臟損傷具有一定的保護(hù)作用，但是這種保護(hù)作用的具體機(jī)制仍需更深入的研究。

綜上，蘆丁能夠控制高糖、高脂飲食造成的小鼠體質(zhì)量增加，增加腎臟組織GSH-Px的活性并降低MDA水平改善氧化應(yīng)激，減輕腎臟組織的結(jié)構(gòu)性損傷，對高糖、高脂飲食導(dǎo)致的小鼠腎臟損害具有一定的保護(hù)作用。