李滋澤，岳 振，胡 楠

皮膚鱗狀細胞癌(鱗癌)約占所有非黑素瘤皮膚癌的20%，是繼基底細胞癌之后第二大常見非黑素瘤皮膚癌[1]。非黑素瘤皮膚癌中不同類型腫瘤的相對比例正在發(fā)生變化，與基底細胞癌相比，皮膚鱗癌的發(fā)病率呈上升趨勢，在老年人群中其增長趨勢尤其顯著[2]。雖然多數(shù)病人通過手術(shù)聯(lián)合放療可以有效治療皮膚鱗癌，但是對于轉(zhuǎn)移病人預后不佳[3]。對于皮膚鱗癌發(fā)病機制的深入研究尤為重要。微小RNA(microRNA，miR)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通常在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用，通過抑制翻譯過程或降解靶mRNA來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達。miR與幾乎所有正常細胞功能相關，廣泛參與包括增殖、分化和凋亡在內(nèi)的各種細胞活動。miR-127位于母系印跡基因Dlk1/Gt12區(qū)域內(nèi)[4]，主要受到小異二聚體配體和雌激素相關受體γ等核受體信號的調(diào)控[5]，其在結(jié)直腸癌、急性髓性白血病以及骨肉瘤等腫瘤中表達明顯升高[6-8]。但目前對于miR-127在皮膚鱗癌中的研究較少，本研究通過檢測miR-127在皮膚鱗癌、癌旁組織中的表達水平差異，同時調(diào)控miR-127在皮膚鱗癌細胞系中的表達，探討miR-127對皮膚鱗癌細胞的生物學行為調(diào)控作用，為臨床診療提供參考?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 標本采集及細胞株 收集2017年8月至2021年6月間于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科確診的21例皮膚鱗癌病人的鱗癌標本及周邊正常皮膚組織，所有收集標本均經(jīng)病理檢查明確診斷及腫瘤細胞惡性程度判定。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準，所有標本提供者均簽署知情同意書。HaCaT細胞、A431細胞以及HSC-5細胞均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。

1.2 實驗試劑 Trizol 總RNA 抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司；Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連) 有限公司；SYBR GreenⅠ熒光染料試劑盒購于美國Thermofisher公司；miR-127引物購自于上海吉瑪生物有限公司。

1.3 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測 使用Trizol法提取標本總RNA，并用Nano-Drop2000 紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度(A260：A280)，后進行凝膠電泳，將瓊脂糖膠置于BioRad GELDOC XR+凝膠成像掃描儀內(nèi)掃描檢測PCR產(chǎn)物。按照Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求將miR 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR 或保存于-20 ℃保存待用。采用SYBR GreenⅠ法進行miR-127的實時熒光定量檢測。反應體系如下：miR-127逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，SYBR Green Mix 9 μL，上下游引物各1 μL，加入DEPC水將反應總體系配至20 μL。PCR反應程序如下，預變性：94 ℃ 5 min，變性：94 ℃ 30 s，退火：58 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，設置30個反應循環(huán)。同時將U6作為內(nèi)參基因。miR-127逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AAG CCA A-3′；miR-127上游引物為5′-GCG GCT CGG ATC CGT CTG AGC T-30；miR-127下游引物為5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；U6上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；U6下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。每個實驗重復進行3次，目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.4 蛋白免疫印跡實驗 采用細胞裂解液獲得細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離出的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，采用一抗封閉過夜，次日采用二抗孵育，后于ECL顯影液中浸潤，暗室中顯影，采用Image J對蛋白條帶測量灰度值。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染 分別將miR-127模擬物(miR-127 agomir)，miR-127抑制物(miR-127 antagomir)以及各自對照試劑(NC agomir和NC antagomir)(上海吉瑪生物技術(shù)公司)以及l(fā)ipofectamine 3000(Thermo Fisher 公司)充分混合后加入A431細胞中，37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培育48 h后以供后續(xù)實驗。

1.6 細胞增殖實驗 采用CCK8法檢測A431細胞的增殖能力，將105個細胞加入96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置入37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培育，分別檢測24、48以及72 h的吸光度值。

1.7 細胞侵襲實驗 將105個細胞加入鋪有matrigel膠的transwell小室上層，小室下層加入10%FBS的細胞培養(yǎng)基，入37℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培育48 h后取出采用結(jié)晶紫染色，觀察顯微鏡視野下的細胞數(shù)。

1.8 熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)預測結(jié)果克隆靶基因中含有的miR-127結(jié)合位點序列以及靶基因3′UTR中含有的miR-127結(jié)合位點序列，將以上序列分別插入到psiCHECK2載體中，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體。將miR-127 agomir或NC agomir分別與上述重組載體共轉(zhuǎn)染HEK-293 T細胞，采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測熒光強度。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、方差分析及q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 皮膚鱗癌組織及癌旁組織中miR-127的表達情況 采用qRT-PCR檢測皮膚鱗癌組織以及癌旁組織中miR-127的表達水平，結(jié)果顯示，miR-127在皮膚鱗癌組織中表達2.94±0.25，明顯高于癌旁組織的1.17±0.17(t=10.14，P<0.01)，在皮膚鱗癌組織中含量為癌旁組織的2.9倍。

2.2 皮膚鱗癌細胞中miR-127的表達水平 分別收集HaCaT細胞、A431細胞以及HSC-5細胞中的RNA，采用qRT-PCR檢測3種細胞中miR-127的表達水平。相較于HaCaT細胞，miR-127表達水平在A431細胞以及HSC-5細胞中顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 miR-127在HaCaT細胞、A431細胞以及HSC-5細胞中的相對表達水平

2.3 miR-127對皮膚鱗癌細胞生物學調(diào)控的影響 分別將miR-127 agomir.miR-127 antagomir以及NC agomir和NC antagomir轉(zhuǎn)染A431細胞，結(jié)果顯示，上調(diào)miR-127表達后，A431細胞的增殖及侵襲能力顯著增強；下調(diào)miR-127的表達后，A431細胞的增殖及侵襲能力受到抑制(P<0.05)(見圖1、表2)。

表2 調(diào)控miR-127后細胞侵襲能力比較

2.4 miR-127調(diào)控皮膚鱗癌細胞的可能作用途徑 通過生物信息學預測網(wǎng)站我們發(fā)現(xiàn)miR-127與抑癌基因PTEN存在結(jié)合位點，進一步通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炍覀儼l(fā)現(xiàn)miR-127可以與PTEN直接結(jié)合(見圖2)。調(diào)控miR-127后PTEN在蛋白水平的表達發(fā)生改變，其中miR-127+PTEN組熒光素酶相對強度高于Control+PTEN組，Control+PTENmut組熒光素酶相對強度均高于miR-127+PTENmut組(P<0.05)；miR-127 agomir組PTEN蛋白表達水平低于NC agomir組和NC antagomir組，miR-127 antagomir組PTEN蛋白表達水平高于NC agomir組和NC antagomir組(P<0.05)(見表3～4)。

表3 調(diào)控miR-127后不同組熒光素酶相對強度比較

表4 不同調(diào)控組PTEN蛋白表達水平

3 討論

miR是由雙鏈RNA經(jīng)過剪切、修飾后做得到的短鏈小分子RNA，一般長度在20～24個核苷酸。其自身通常不參與編碼合成mRNA，而是在轉(zhuǎn)錄后水平參與靶基因調(diào)控過程。miR是近年來表觀遺傳學方面研究的熱點，主要通過抑制它的靶基因來起調(diào)控作用，其作用遍及生命體的發(fā)生、生長、發(fā)育、分化和死亡的各個過程。許多研究已經(jīng)證實多種miR在皮膚鱗癌中的表達量存在異常，如WANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)皮膚鱗癌中miR-31表達異常增高，且miR-31可以調(diào)控皮膚鱗癌細胞的遷移及集落形成能力；MiR-216b可通過結(jié)合TPX2從而激活p53信號通路，抑制皮膚鱗癌的遷移、侵襲及成血管能力[10]。此外，還有研究[11]列舉了miR-21、miR-205、miR-365、miR-31等miR，這些異常表達的miR可能與細胞增殖分化、凋亡、血管形成、腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移等多種功能相關。

對于miR-127在皮膚鱗癌作用的相關研究較少。miR-127與miR-431，miR-433、miR-127、miR-432和miR-136等屬于同一簇，miR-127和miR-433存在重疊的基因區(qū)域，但擁有彼此獨立的啟動子，并且這2種miRNA的表達均受到雌激素相關受體γ誘導并且被小異源二聚體配體的抑制。有研究[12]表明miR-127在胎兒肺發(fā)育晚期期間表達水平最高，因此可能在此過程中發(fā)揮重要作用。此外，miR-127調(diào)節(jié)BCL6介導的CDKN1A的表達，在大鼠肝細胞中，miR-127的下調(diào)促進細胞增殖，而miR-127的上調(diào)抑制增殖[13]。在多種腫瘤細胞中，miR-127也參與其生物學功能調(diào)控。GUO等[14]發(fā)現(xiàn)miR-127在胃癌細胞中的表達水平受到抑制，而上調(diào)其表達可抑制腫瘤的生長。除了胃癌等實體腫瘤，miR-127可能在皮膚腫瘤中發(fā)揮作用，而在本研究中，我們對比了皮膚鱗癌組織與正常組織中miR-127的表達水平差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在皮膚鱗癌組織中，miR-127的表達水平升高，提示miR-127可能參與了鱗癌細胞的發(fā)生發(fā)展過程，這個結(jié)果與CAI等[15]發(fā)現(xiàn)相一致。此外，我們通過體外調(diào)控miR-127的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮膚鱗癌細胞的增殖和侵襲能力受到調(diào)控；同一miR可作用于多個靶基因，如miR-127可作用于DLK1從而影響黑素瘤的進展[16]，miR-127也可抑制Wnt7a的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程從而調(diào)控胃癌的生長[17]；而本研究進一步檢測miR-127的作用靶基因，驗證了miR-127可作用于PTEN的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-127在皮膚鱗癌組織中表達顯著上升，同時其表達水平與鱗癌細胞的生物學行為存在聯(lián)系，且這種調(diào)控與作用于PTEN有關。因此我們認為miR-127可能作為一個潛在的分子生物學標志物，可能成為臨床診治的一個重要靶點。