趙建英，張森虎，李艷松，李 詳，白 建

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033001）

小米有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，常被用來(lái)制作各種養(yǎng)生粥，還可以用來(lái)發(fā)酵釀酒，因此對(duì)小米多糖的工藝提取可以開(kāi)發(fā)出新的營(yíng)養(yǎng)豐富且健康的食品（Yang等，2021）。 高晶晶等（2020）研究表明，小米多糖具有一定的抗氧化性，其質(zhì)量濃度與抗氧化性成正比。王璽等（2016）研究表明，多糖提取率與液固比成正相關(guān)，增大液固比，多糖能夠有效的融到溶液中，提高多糖提取率。劉丹丹等（2019）研究表明，多糖可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏染色為紫色的抑菌效果最好。宋樂(lè)園（2020）通過(guò)對(duì)紅小米多糖提取研究后，得出了紅小米多糖的最佳提取條件。路志芳等（2017）研究表明，植物多糖可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)和食品保健領(lǐng)域等，目前已經(jīng)利用植物多糖研發(fā)出一些醫(yī)療藥品，治療病毒感染和腫瘤，改善人體的免疫功能，預(yù)防心血管疾病等，比如香菇多糖的應(yīng)用。Wang等（2019）研究表明，原位葡聚糖生產(chǎn)改變了小米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，導(dǎo)致游離酚類(lèi)含量和抗氧化活性增加。已有的研究發(fā)現(xiàn)HSP-3可作為功能性食品中的活性成分（Huo等，2020；Sharma等，2019）。

本研究以沁州小米為主要原料，按單因素試驗(yàn)，選出提取時(shí)間、提取溫度、料液比三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)（高濤等，2020），確定小米多糖最佳提取條件。對(duì)提取出的小米多糖采用濾紙片法（Xu等，2020；Li等，2019）進(jìn)行抑菌研究，測(cè)定其對(duì)供試菌的抑菌效果，確定最低抑菌濃度。并研究不同溫度和pH對(duì)小米多糖抑菌能力的影響，為小米多糖的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 沁州小米采購(gòu)于呂梁星瑪客超市，酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、苯酚、牛肉膏、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂等均是分析純，供試菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）由呂梁學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海禾汽玻璃儀器有限公司；SC-04低速離心機(jī)：張家港市騰鷹機(jī)械制造有限公司；FA114A電子秤：廣東豪晟科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：河南省泰斯特儀器有限公司；UV-1601紫外分光光度計(jì)：青島聚創(chuàng)華業(yè)分析儀器有限公司；101-00AB恒溫鼓風(fēng)干燥箱：邢臺(tái)鉅都科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小米預(yù)處理 將沁州小米置于60℃恒溫干燥箱中，干燥40 min。

1.3.2 小米多糖提取 取5 g小米放入燒杯中，加入100 mL蒸餾水，將燒杯放入恒溫水浴鍋中，在80℃下浸提2 h，取出提取液用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，然后將濾液用低速離心機(jī)3900 r/min離心25 min，然后取上清液，加入60 mL 95%乙醇，再3900 r/min離心20 min，然后過(guò)濾，得到小米粗多糖（諸愛(ài)士等，2019），溶解沉淀并定容，取15 mL溶液與燒杯中，然后加鹽酸溶液2 mL，置于60℃水浴鍋中加熱20 min，靜置冷卻，然后滴一滴酚酞試劑，用2 mL 2 mol/mL的氫氧化鈉溶液滴定至淡紅色，將溶液倒入50 mL容量瓶中，搖勻得到小米多糖溶液，用3，5二硝基-水楊酸法（王明瑞等，2020）檢測(cè)多糖的含量，以此計(jì)算小米多糖提取率。

1.3.3 DNS試劑配制 稱(chēng)取3，5-二硝基水楊酸3.15 g，酒石酸鉀鈉91.0 g，苯酚2.50 g和無(wú)水亞硫酸鈉2.50 g，采用詹夢(mèng)濤等（2020）的方法配制DNS試劑。配制完成后，放置在棕色瓶中避光儲(chǔ)存，室溫下存放一周后使用。

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)羅春萍等（2021）的方法配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取葡萄糖 標(biāo) 準(zhǔn) 液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL和1.60mL于5mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)至2.50mL，滴加DNS試劑2 mL，100℃加熱10 min，然后靜置冷卻，在波長(zhǎng)為540 nm處進(jìn)行檢測(cè)，讀出吸光度值。繪制葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 小米多糖含量的測(cè)定 取2 mL小米多糖溶液于25 mL具塞試管中，加入2 mL DNS試劑，加熱一段時(shí)間，然后靜置冷卻，加入10 mL蒸餾水，對(duì)照組用蒸餾水，然后在540 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，讀出吸光度值，計(jì)算出小米多糖的提取率（張小貝等，2017）。小米多糖提取率的計(jì)算公式：φ＝（（ρ-V）×0.9）/m×100。

1.4 單因素試驗(yàn) 由預(yù)試驗(yàn)得到提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80℃，液料比為20：1，多糖提取率最高達(dá)3.27%。分別改變提取時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h），提取溫度（70、75、80、85、90℃），料液比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1），以此進(jìn)行小米多糖的提取。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 利用單因素試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，進(jìn)行BBD響應(yīng)面法試驗(yàn)（張環(huán)宇等，2020），以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）作為三個(gè)影響因素，以小米多糖提取率為考察指標(biāo)。響應(yīng)面分析因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.6 小米多糖抑菌試驗(yàn)

1.6.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制作 采用湯強(qiáng)等（2018）的方法配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在無(wú)菌環(huán)境下操作。

1.6.2 菌懸液的制備 取10 mL的蒸餾水于試管中，用酒精燈加熱，在酒精燈旁冷卻后倒入接種管中，塞上棉塞，搖晃7～9次，然后倒入試管中，備用。

1.6.3 抑菌圈的測(cè)定 把濾紙用打孔器做成直徑為6 mm大小的形狀，在培養(yǎng)皿中加入5 mL過(guò)濾后的小米多糖提取液，充分浸泡1 h后，用酒精燈灼燒鑷子，待冷卻后用鑷子將濾紙貼在培養(yǎng)基上，然后放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。用無(wú)菌水為對(duì)照組，測(cè)量抑菌圈的直徑大小，試驗(yàn)進(jìn)行3次，取中間值（李世杰等，2018）。配制10 mg/mL的青霉素鈉溶液為陽(yáng)性對(duì)照（許海燕等，2020）。

1.6.4 小米多糖最低抑菌濃度的測(cè)定 用二倍肉湯稀釋法（毛暢思等，2021）測(cè)定小米多糖提取液的最低抑菌濃度（MIC），小米多糖提取液用無(wú)菌水連續(xù)稀釋最終質(zhì)量濃度為0、0.1427、0.2854、0.5708、1.1416、2.2832、4.5664、9.1328 mg/mL， 在37℃恒溫培養(yǎng)箱培育24～36 h后，當(dāng)試管中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)時(shí)，以測(cè)定最小抑菌濃度。

1.6.5 不同溫度對(duì)小米多糖抑菌能力的影響 將提取出的小米多糖均分為5份，放入燒杯中，在恒溫條件下將小米多糖提取液的溫度調(diào)為20、50、80、100、130℃，并恒溫加熱30 min，以無(wú)菌水為對(duì)照組，然后用濾紙片法對(duì)3種供試菌的抑菌效果進(jìn)行測(cè)定，平行3次試驗(yàn)（唐志凌等，2021；高晶晶等，2020）。

1.6.6 不同pH對(duì)小米多糖抑菌能力的影響 將提取出的小米多糖均分為5份，利用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液將小米多糖提取液的pH調(diào)為1、4、7、10、13， 以無(wú)菌水為對(duì)照組，然后用濾紙片法對(duì)3種供試菌的抑菌效果進(jìn)行測(cè)定，平行3次試驗(yàn) （吳孔陽(yáng)等，2021；劉永永等，2021；吳孔陽(yáng)等，2020）。

1.7 數(shù)據(jù)處理 所有的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)都在Microsoft Excel 2010中歸納整理，單因素試驗(yàn)作圖利用Graphpad Prism8.0，利用Design-ExPert 11軟件對(duì)Box-Behnken（BBD）響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行分析，最后使用Adobe Photoshop CC 2021對(duì)所得的所有圖片進(jìn)行修飾。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：Y＝0.6157X－0.0712，R2＝0.984。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)小米多糖提取率的影響 圖2表明，在提取1～2 h時(shí)，小米提取率從1.26%增長(zhǎng)到2.86%，提取時(shí)間增加后，提取率又開(kāi)始降低。這是因?yàn)橛脽崴釙r(shí)，小米在一段時(shí)間后才能破壞細(xì)胞壁，而多糖要溶解在溶液中也需要一定的時(shí)間，一定時(shí)間浸提后，更多的多糖溶解到溶液中，而提取時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使的多糖在高溫下發(fā)生糖酵解，穩(wěn)定性降低，所以小米多糖最佳提取時(shí)間為2 h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)小米多糖提取率的影響 由圖3可以看出，在溫度為70～80℃時(shí)，隨著溫度的升高，多糖提取率升高，在80℃后，多糖提取率下降，這是因?yàn)闊崽幚砜梢云茐男∶准?xì)胞，使多糖溶解在水中，溫度升高會(huì)提高物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，加快溶解。在一定的時(shí)間內(nèi)使多糖提取率增加，但過(guò)高的溫度會(huì)使多糖變性，而使多糖提取率減少。因此，小米多糖的最佳提取溫度為80℃。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對(duì)小米多糖提取率的影響 從圖4可以看出，料液比可改變?nèi)芤旱臐舛纫约叭芤吼ざ鹊?，?dāng)料液比的比例變大時(shí)，溶液中多糖的濃度降低，多糖提取率增大。但當(dāng)料液比的比例太大時(shí)，溶解速度過(guò)快，多糖提取變得困難，增加了損耗，導(dǎo)致多糖損失。由圖4可以看出，當(dāng)料液比增大時(shí)，多糖提取率快速增加，而料液比再變大后，多糖提取率反而降低。因此，當(dāng)料液比為20：1時(shí)，小米多糖提取量最多。

圖4 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 運(yùn)用Design-Expert 11軟件對(duì)表1和表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，并進(jìn)行模型優(yōu)化，得到回歸方程：Y＝3.04+0.1963A+0.0510B—0.0890C—0.0438AB+0.0413AC+0.0317BC-0.4989A2-0.2054B2-0.2919C2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

對(duì)模型的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，由表3可知，響應(yīng)面模型P＜0.0001，表明擬合檢驗(yàn)極顯著，失擬檢驗(yàn)P＝0.9814＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，這說(shuō)明方程模擬比較好，可以用該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。

由表3可以看出，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9957，表明模型顯著。校正系數(shù)R2Adj＝0.9901，說(shuō)明該模型只有0.99%無(wú)法解釋。兩個(gè)差值小于0.2，說(shuō)明具有一致性，模型與實(shí)際情況擬合很好。變異系數(shù)CV＝1.42%，模型可靠，可以較好地反映真實(shí)試驗(yàn)值，所選用的二次多項(xiàng)模型有效。

對(duì)模型的各系數(shù)顯著性檢驗(yàn)分析可知 （表3），因素A、B、C表現(xiàn)為極顯著；交互項(xiàng)AB表現(xiàn)為顯著，AC、BC表現(xiàn)為不顯著， 二次線A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著。該模型中的F值可以看出三個(gè)因素對(duì)多糖提取率都有非常顯著的影響，其中A、B、C的值分別為230.03、15.53、47.31，所以可以得出A、B、C對(duì)多糖提取率的影響力由大到小為：提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 交互作用分析 由圖5可知，因素A與因素B相互作用3D曲面彎折程度大，坡度較峭，且等高線為橢圓形，說(shuō)明因素A與因素B之間的交互作用對(duì)小米多糖的提取率影響顯著。從3D圖可以看出，當(dāng)因素A為2 h，因素B為80℃時(shí)小米多糖提取率最高，為3.051%。從等高線可以看出，因素B對(duì)小米多糖提取率的影響小于因素A，說(shuō)明在因素A與因素B中，小米多糖提取率主要受因素A的影響。

圖5 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖6可知，因素A與因素C相互作用3D曲面彎折程度小，坡度較緩，且等高線近似為圓形，說(shuō)明因素A與因素C之間的交互作用對(duì)小米多糖的提取率影響不顯著。從3D圖可以看出，當(dāng)因素A為2 h，因素C為20：1時(shí)小米多糖提取率最高，為3.042%。從等高線可以看出，因素C對(duì)小米多糖提取率的影響小于因素A，說(shuō)明在因素A與因素C中，小米多糖提取率主要受因素A的影響。

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖7可知，因素B與因素C相互作用3D曲面彎折程度小，坡度較緩，且等高線近似為圓形，說(shuō)明因素B與因素C之間的交互作用對(duì)小米多糖的提取率影響不顯著。從3D圖可以看出，當(dāng)因素B為80℃，因素C為20：1時(shí)小米多糖提取率最高，達(dá)2.969%。從等高線可以看出，因素B對(duì)小米多糖提取率的影響小于因素C，說(shuō)明在因素B與因素C中，小米多糖提取率主要受因素C的影響。

圖7 提取溫度和料液比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，將提取時(shí)間、提取溫度、料液比的取值分別設(shè)定為1.5～2.5 h，75～85℃，15：1～25：1，并將目標(biāo)值設(shè)定為最大值。獲得的最佳提取條件為：提取時(shí)間2.11 h，提取溫度80.6℃，料液比19.2：1。按此提取條件提取的小米多糖提取率為3.067%，根據(jù)實(shí)際操作情況將最優(yōu)組合修改為提取時(shí)間2.1 h，溫度80℃，料液比19：1，在此條件下平行3次試驗(yàn)。提取的小米多糖提取率為3.066%，與預(yù)測(cè)值接近，這說(shuō)明回歸模擬準(zhǔn)確可用，利用響應(yīng)面結(jié)合主成分分析法優(yōu)化小米多糖的提取的方法準(zhǔn)確可行。

2.5 小米多糖的抑菌能力

2.5.1 小米多糖對(duì)供試細(xì)菌的抑菌測(cè)定 由表4可知，小米多糖對(duì)供試菌都具有抑制作用。且相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，小米多糖的抑菌效果更強(qiáng)，其中小米多糖對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果最好，其抑菌直徑可達(dá)（12.75±1.76）mm。小米多糖對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果較弱，其抑菌圈直徑為 （10.03±1.53）mm，小米多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最弱，其抑菌圈直徑為（8.77±0.79）mm。

表4 小米多糖對(duì)供試菌的抑菌效果 mm

2.5.2 小米多糖對(duì)供試菌的最低抑菌濃度 由表5可知，小米多糖提取液對(duì)三個(gè)供試菌的最小抑制濃度分別為1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL， 小米多糖提取液對(duì)細(xì)菌的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。

表5 小米多糖對(duì)供試菌的最低抑菌濃度

2.5.3 不同溫度下小米多糖對(duì)供試菌抑菌的測(cè)定從圖8可以看出，溫度的變化不會(huì)明顯影響小米多糖的抑菌效果，即使120℃下處理小米多糖后，其仍然具有抑菌能力。但隨著溫度的升高，小米多糖的抑菌效果會(huì)稍微降低，這是由于高溫破壞了小米多糖的結(jié)構(gòu)。

圖8 不同溫度對(duì)供試菌抑菌的影響

2.5.4 不同pH下小米多糖對(duì)供試菌的測(cè)定 從圖9可以看出，不同酸堿度條件下的小米多糖的抑制作用有所不同，pH越趨于中性，小米多糖的抑菌效果越佳，在pH為7時(shí)，小米多糖對(duì)大腸桿菌的抑制效果最佳。而在酸性或堿性條件下，小米多糖的抑制能力都會(huì)受到影響，pH越低或越高，小米多糖的抑制能力越弱，這是由于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿會(huì)破壞小米多糖的結(jié)構(gòu)，活性降低，從而影響小米多糖的抑菌效果。

圖9 不同pH對(duì)供試菌的影響

3 結(jié)論

用熱水提法對(duì)沁州小米進(jìn)行多糖提取，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)小米多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化得出：在提取時(shí)間2.1 h、提取溫度80℃、料液比19：1條件下，沁州小米多糖的平均提取率為3.066%。通過(guò)響應(yīng)面模型分析可以得出，三個(gè)因素對(duì)小米多糖提取率的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞料液比＞提取溫度。對(duì)提取出的小米多糖進(jìn)行抑菌作用研究表明，小米多糖對(duì)三種供試細(xì)菌都有一定的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為1.1416、2.2832、4.5664 mg/mL。 對(duì)在不同溫度和pH條件下小米多糖對(duì)供試菌的抑菌研究得出，溫度的升高并不會(huì)明顯影響小米多糖的抑菌效果，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿會(huì)降低小米多糖的抑菌效果，在中性條件下，小米多糖的抑制效果最佳。