王蘭英，姜 玲，趙 靜，李紹平*

1.珠?？萍紝W(xué)院 藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海 519041

2.澳門(mén)大學(xué) 中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 澳門(mén) 999078

冬蟲(chóng)夏草(C.sinensis)作為藥用真菌中的珍稀品種，主要是麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲(chóng)上，侵染后使蟲(chóng)體僵化在幼蟲(chóng)頂部長(zhǎng)出子座和僵蟲(chóng)菌核，形成干燥的蟲(chóng)和菌的復(fù)合體[1]，其內(nèi)含豐富的生物活性物質(zhì)，具有廣泛藥理作用。目前，由于自然環(huán)境的破壞和人為過(guò)度采伐等諸多因素導(dǎo)致野生蟲(chóng)草資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉是從青海野生冬蟲(chóng)夏草中人工分離獲得的麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草(C.sinensis(Berk.)Sae.)的無(wú)性世代——中華束絲孢(SynnematumsinenseYinetShen sp.now)經(jīng)人工液體深層發(fā)酵、干燥加工獲得菌絲體的干燥粉末[2]。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉成分、藥理作用與天然冬蟲(chóng)夏草基本一致[3]，是天然冬蟲(chóng)夏草最好的替代品[4]。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉主要由多糖類(lèi)、核苷類(lèi)、氨基酸及其衍生物、甾醇類(lèi)、醇類(lèi)、鞘脂類(lèi)等多種成分構(gòu)成[5-6]，其中多糖研究一直以來(lái)都是新資源功能食品及保健食品研發(fā)的熱點(diǎn)，具有提高機(jī)體免疫[7]、抗氧化[8-9]、保肝護(hù)肝[10]、抗腫瘤[11]、平衡血脂血糖[12]等作用。本試驗(yàn)中所用發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品分離自青海野生冬蟲(chóng)夏草，鑒定菌株后并已成功投入規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，以菌絲體生產(chǎn)活性多糖及生物量為指標(biāo)獲得穩(wěn)定高產(chǎn)發(fā)酵工藝。從發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中提取得到的蟲(chóng)草多糖樣品具有濃郁奶香味，是菌粉中主要活性成分之一。作者通過(guò)對(duì)該菌株發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草菌粉及發(fā)酵液樣品提取的多糖進(jìn)行體外抗氧化活性及免疫活性能力的比較，以期為該菌株發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及發(fā)酵液的利用和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 菌種及菌粉樣品

蟲(chóng)草菌由澳門(mén)大學(xué)中華醫(yī)藥研究院提供。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉取自100 L發(fā)酵罐中穩(wěn)定發(fā)酵、離心干燥處理后的樣品。

1.2 主要試劑

脂多糖(LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、modified griess：Sigma-Aldrich Lab and Production Materials；三羥基氨基甲烷、聯(lián)苯三酚、水楊酸、鐵氰化鉀、2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、抗壞血酸：上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸：茂名市雄大化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海思域化工科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司；無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；七水硫酸亞鐵：鞏義市金源化工有限公司；30%過(guò)氧化氫：武漢純度生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉：北京福瑞生物科技有限公司；三氯乙酸、三氯化鐵、過(guò)硫酸鉀：西隴化工股份有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

FA2204B型精密天平：上海精密儀器儀表有限公司；PS-10AD型超聲儀：深圳市良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；移液槍?zhuān)嘿惸w世爾科技公司；HWS-24型水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XH-B型旋渦混合器：江蘇天翎儀器有限公司；UV-2600型紫外光譜儀、IRPrestige-21型紅外光譜儀：日本島津；酶標(biāo)儀：珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 多糖提取方法

將蟲(chóng)草菌絲體干燥至恒質(zhì)量，粉碎過(guò)50目篩。精確稱(chēng)取0.100 g菌絲體粉末，以30∶ 1 (mL/g)的液料比加入蒸餾水，并于80 ℃水浴鍋中浸提2 h。4 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)上述操作3次，合并濾液，濃縮至原體積的1/3。三氯甲烷-正丁醇(體積比為4∶ 1)與多糖濃縮液以1∶ 5進(jìn)行振蕩充分混合，4 000 r/min離心5 min除蛋白層。用活性炭(0.02 g/mL)除色素，40 ℃攪拌脫色2 h，重復(fù)3次后過(guò)濾收集濾液。濾液以1∶ 3逐滴、振搖加入無(wú)水乙醇，于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。4 000 r/min離心獲得沉淀，分別用乙醚、丙酮、無(wú)水乙醇洗滌，烘干即得多糖樣品。

2.1.2 單因素試驗(yàn)

以液料比30∶ 1 (mL/g)，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h為考察基礎(chǔ)條件。精確稱(chēng)取0.100 g菌絲體粉末，分別以液料比20∶ 1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1、60∶ 1、70∶ 1、80∶ 1、90∶ 1、100∶ 1 (mL/g)，提取溫度30、40、50、60、70、80、90 ℃，提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5、3 h進(jìn)行提取，考察各因素對(duì)多糖提取的影響。

2.1.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以提取時(shí)間、液料比、提取溫度為因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，使用L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.4 多糖含量測(cè)定

從上述提取獲得的多糖樣品溶液中吸取0.01 mL,補(bǔ)水至1.00 mL，采取蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量[13]。以葡萄糖為對(duì)照繪制質(zhì)量濃度梯度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其擬合線性回歸方程為y=2.625 7x-0.001，決定系數(shù)R2=0.999 9。按下式計(jì)算蟲(chóng)草多糖含量(W)：

式中: C為樣品糖含量，mg/mL；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；V為所測(cè)樣品提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mg。

2.2 多糖樣品制備

按上述優(yōu)化后的提取工藝對(duì)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉和發(fā)酵液進(jìn)行多糖提取及純化處理，獲得蟲(chóng)草胞內(nèi)粗多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液粗多糖、發(fā)酵液純化多糖樣品。精確配制4種多糖樣品溶液質(zhì)量濃度為10mg/mL，超聲輔助振蕩使其溶解完全，即得蟲(chóng)草多糖樣品母液。

2.3 蟲(chóng)草多糖特征吸收峰的檢測(cè)

2.3.1 紫外光譜法分析多糖樣品

按2.2中步驟配制4種多糖樣品母液，以超純水為對(duì)照，使用島津UV-2600在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)間隔為1nm進(jìn)行多糖樣品光譜掃描。

2.3.2 紅外光譜法分析多糖樣品

采用傅里葉紅外色譜法，分別稱(chēng)取提前干燥至恒定質(zhì)量0.001g4種蟲(chóng)草多糖樣品和0.100gKBr粉末，在研缽中研磨均勻并壓制成待測(cè)片劑樣品，在4 000～400cm-1范圍進(jìn)行光譜掃描。

2.4 多糖樣品的抗氧化能力分析

2.4.1 蟲(chóng)草多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

配制抗壞血酸和多糖樣品(0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/mL)，取上清液。參考劉城移等[14]的方法，加1.00mLDPPH(2mmol/L)溶液，渦旋混合5s，避光放置30min，測(cè)定多糖樣品反應(yīng)液于517nm下的吸光度Ax；以樣品溶液與無(wú)水乙醇反應(yīng)液為對(duì)照組，吸光度為Ad；空白參比溶液為蒸餾水，和DPPH溶液混合，測(cè)得的吸光度為Ao。陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸組按上述操作進(jìn)行處理，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

2.4.2 蟲(chóng)草多糖對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考Chen等[15]的方法略加修改，等體積依此加入1.00mL硫酸亞鐵(9mmol/L)、H2O2(8.8mmol/L)和鄰羥基苯甲酸溶液(9mmol/L)，混勻后在水浴37 ℃下反應(yīng)30min，靜置25min后測(cè)定510nm處樣品溶液吸光度Ax；空白參比溶液以等體積H2O代替多糖樣品反應(yīng)，測(cè)得的吸光度為Ao；對(duì)照組以等體積H2O代替鄰羥基苯甲酸、硫酸亞鐵和H2O2溶液反應(yīng)，測(cè)得的吸光度為Ad。陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸組按上述操作進(jìn)行處理，按下式計(jì)算樣品羥基自由基清除率。

2.4.3 蟲(chóng)草多糖總還原能力測(cè)定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考何晉浙等[16]的方法進(jìn)行總還原力測(cè)定，空白參比溶液為2.500mLH2O代替多糖樣品進(jìn)行同樣反應(yīng)，測(cè)定各組溶液700nm下的吸光度?？箟难峤M按多糖樣品的操作進(jìn)行處理作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.4.4 蟲(chóng)草多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考何晉浙等[16]的方法略加修改，依次加入2.250mLTris-HCl緩沖溶液、2.00mL樣液、0.050mL60mmol/L聯(lián)苯三酚溶液，振蕩搖勻后加入0.020mLHCL溶液(10mol/L)終止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)溶液325nm下的吸光度Ax?？瞻捉M以2.00mLH2O取代樣品反應(yīng)測(cè)得的吸光度為Ao。對(duì)照組以H2O取代聯(lián)苯三酚反應(yīng)測(cè)得的吸光度為Ad?？箟难峤M按上述操作進(jìn)行處理作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

2.4.5 蟲(chóng)草多糖對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考梁紅敏等[17]的方法，分別取1.00mL樣品溶液，加3.000mLABTS溶液，黑暗條件下放置1h，測(cè)定734nm處的吸光度Ax?？瞻讌⒈热芤簽榈润w積H2O代替多糖樣品反應(yīng)測(cè)得的吸光度為Ao。對(duì)照組以磷酸鹽緩沖液代替ABTS，吸光度為Ad?？箟难峤M按上述操作進(jìn)行處理作為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算ABTS自由基清除率。

2.5 蟲(chóng)草多糖免疫活性能力測(cè)定

2.5.1 多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖能力的影響

用PBS溶液配制蟲(chóng)草胞內(nèi)及發(fā)酵液粗多糖樣品(500、250、125、62.500、31.250、15.625、7.813、3.906μg/mL)和陽(yáng)性對(duì)照組脂多糖(LPS，0.4μg/mL)。參考Deng等[18]的方法進(jìn)行試驗(yàn)，于570nm下測(cè)定吸光度。細(xì)胞活力表示為多糖處理組和未經(jīng)多糖處理的空白試驗(yàn)組之間的吸光度的比值。

2.5.2 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO的影響

配制脂多糖(LPS)和多糖樣品(同2.5.1)，取上清液。參考Wu等[19]的方法進(jìn)行試驗(yàn)，于540nm下測(cè)定吸光度。細(xì)胞NO的產(chǎn)生量表示為多糖處理組與LPS處理組之間的吸光度之比。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每次試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，采用Origin軟件處理數(shù)據(jù)作圖，用Excel、SPSS軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

液料比對(duì)多糖提取的影響如圖1a所示，隨著液料比增加多糖含量隨之增加，當(dāng)液料比達(dá)到90∶ 1 (mL/g)時(shí)達(dá)到最高值。提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響如圖1b所示，當(dāng)提取時(shí)間低于1.5h時(shí)，多糖含量顯著增加，在1.5h達(dá)到最高值，超過(guò)1.5h后多糖含量降低。提取溫度對(duì)多糖提取的影響如圖1c所示，隨著溫度的上升，多糖含量隨之增加，在60 ℃達(dá)到最高值。因此，在單因素優(yōu)化試驗(yàn)中液料比為90∶ 1 (mL/g)、提取時(shí)間為1.5h、提取溫度為60 ℃條件下粗多糖百分含量最高。

圖1 單因素對(duì)多糖含量的影響

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，影響發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖提取的因素重要性排序?yàn)锳>B>C，最佳熱水浸提條件組合為A3B3C2，即提取溫度為65 ℃，液料比為95∶ 1 (mL/g)，提取時(shí)間為1.5h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

3.3 蟲(chóng)草多糖紫外光譜分析

如圖2所示，4種多糖樣品在200nm附近出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，從發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉提取的2種多糖樣品在260nm和280nm處有較強(qiáng)吸收峰，純化處理后的胞內(nèi)純化多糖樣品的核酸(260nm)、蛋白質(zhì)及多肽(280nm)含量相對(duì)較少。從發(fā)酵液中提取的多糖在260nm和280nm處無(wú)明顯吸收峰，但胞外多糖相較于胞外純化多糖紫外光譜來(lái)看，在260nm和280nm處有較小的凸起峰，判斷可能存在少量的核酸及蛋白質(zhì)[20-21]。

圖2 發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及發(fā)酵液提取多糖的紫外光譜

3.4 蟲(chóng)草多糖紅外光譜分析

圖3 發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及發(fā)酵液提取多糖紅外光譜

3.5 總還原力的測(cè)定結(jié)果

各組樣品還原能力如圖4a所示，隨著質(zhì)量濃度遞增抗壞血酸還原能力逐漸增強(qiáng)，明顯優(yōu)于4種多糖樣品，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4mg/mL時(shí)抗壞血酸吸光度達(dá)到1.941，對(duì)應(yīng)此質(zhì)量濃度的還原能力達(dá)到最高,隨后趨于穩(wěn)定。在0～10mg/mL內(nèi)4種多糖樣品還原能力整體屬于上升趨勢(shì)，但胞內(nèi)及發(fā)酵液多糖存在顯著性差異，且胞內(nèi)多糖相較于發(fā)酵液多糖在還原能力上具有明顯優(yōu)勢(shì)，而同來(lái)源粗多糖和純化多糖相差不大。在10mg/mL下，抗壞血酸組吸光度達(dá)到1.919，4種多糖總還原力強(qiáng)弱依此為胞內(nèi)多糖(0.257)>胞內(nèi)純化多糖(0.250)>發(fā)酵液多糖(0.075)>發(fā)酵液純化多糖(0.071)。

3.6 對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定結(jié)果

各組樣品對(duì)超氧陰離子的清除能力如圖4b所示，各組樣品與質(zhì)量濃度呈明顯量效關(guān)系，整體上來(lái)看抗壞血酸的清除能力較好，在0.2mg/mL下清除率達(dá)到100%。4種多糖樣品對(duì)超氧陰離子的清除能力相差不大，在10mg/mL下胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液多糖、發(fā)酵液純化多糖的清除率可達(dá)到95.49%、80.74%、69.23%、75.73%。發(fā)酵液提取的2種多糖在1.5～5mg/mL范圍內(nèi)，粗多糖清除能力較強(qiáng)，4mg/mL以后發(fā)酵液純化多糖清除能力無(wú)限接近胞內(nèi)純化多糖，且在5mg/mL以后發(fā)酵液純化多糖清除能力優(yōu)于發(fā)酵液多糖。綜合來(lái)看，各組樣品間清除能力強(qiáng)弱依次為胞內(nèi)多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液純化多糖>發(fā)酵液多糖。

3.7 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

各組樣品對(duì)羥基自由基的清除能力如圖4c所示，抗壞血酸及4種多糖樣品在0～10mg/mL范圍內(nèi)隨著溶液質(zhì)量濃度遞增呈現(xiàn)出較好的清除能力。在2mg/mL下，抗壞血酸清除率達(dá)到99.42%；在8mg/mL下胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液多糖、發(fā)酵液純化多糖清除率可達(dá)到65.66%、89.36%、78.94%、48.44%。在4～8mg/mL范圍內(nèi)，蟲(chóng)草多糖樣品清除能力整體趨勢(shì)從大到小依此為胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液多糖>胞內(nèi)多糖>發(fā)酵液純化多糖。

3.8 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

各組樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖4d所示，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，溶液質(zhì)量濃度達(dá)到0.1mg/mL時(shí)清除率達(dá)到96.34%，隨后趨于穩(wěn)定。整組多糖樣品隨質(zhì)量濃度的遞增清除率隨之增大，胞內(nèi)多糖樣品在0～6mg/mL范圍內(nèi)清除率上升至93.86%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能是，多糖樣品在高濃度下溶解達(dá)到飽和，采用超聲攪拌促溶方法導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。胞內(nèi)多糖及胞內(nèi)純化多糖的趨勢(shì)相近，在8mg/mL下胞內(nèi)多糖的清除率高于胞內(nèi)純化多糖，具有較高的清除能力。發(fā)酵液純化多糖相較于發(fā)酵液多糖清除活性更強(qiáng)，在4mg/mL下發(fā)酵液純化多糖清除率達(dá)到98.25%。在10mg/mL下4種多糖樣品清除能力大小依此為發(fā)酵液純化多糖(102.41%)>胞內(nèi)純化多糖(81.70%)>發(fā)酵液多糖(59.78%)>胞內(nèi)多糖(48.51%)。

整組數(shù)據(jù)存在波動(dòng)是由于DPPH適用于有機(jī)溶劑，當(dāng)多糖達(dá)到一定濃度時(shí)，可能造成多糖溶液沉淀從而影響吸光度的測(cè)定。

3.9 對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

各組樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力如圖4e所示，在樣品質(zhì)量濃度為0～10mg/mL范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照及4種多糖樣品均具有較好活性，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，清除能力呈現(xiàn)不同程度的增加。陽(yáng)性對(duì)照組在0.1mg/mL時(shí)清除率可達(dá)到99.94%，胞內(nèi)純化多糖和胞內(nèi)粗多糖的清除率分別在2mg/mL、4mg/mL達(dá)到100%，發(fā)酵液多糖及其純化多糖在8mg/mL達(dá)到97.17%、97.73%。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，發(fā)酵液與發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉提取的多糖均可達(dá)到較高的清除能力，相比之下胞內(nèi)多糖在ABTS自由基清除能力上優(yōu)于發(fā)酵液提取多糖。

圖4 蟲(chóng)草多糖樣品體外抗氧化活性

3.10 多糖樣品抗氧化能力指標(biāo)的對(duì)比

4種多糖樣品抗氧化能力的EC50(抗氧化指標(biāo)清除率達(dá)到50%的多糖樣品有效質(zhì)量濃度[22])和RP0.5 AU(總還原力測(cè)定中反應(yīng)液吸光度達(dá)到0.5時(shí)多糖樣品的質(zhì)量濃度[23])對(duì)比如表3所示。從表3中的EC50來(lái)看，綜合比較4種自由基中胞內(nèi)提取多糖抗氧化能力優(yōu)于發(fā)酵液多糖。在ABTS自由基組EC50中，胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液多糖、發(fā)酵液純化多糖的EC50分別為0.75、0.43、1.67、1.40mg/mL,其對(duì)應(yīng)清除率大小順序?yàn)榘麅?nèi)純化多糖>胞內(nèi)多糖>發(fā)酵液純化多糖>發(fā)酵液多糖；且從本組EC50來(lái)看，純化處理后多糖純度增大會(huì)明顯提高多糖ABTS自由基清除能力。對(duì)DPPH自由基清除能力大小順序?yàn)榘l(fā)酵液純化多糖>胞內(nèi)多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液多糖，對(duì)超氧陰離子自由基清除能力大小順序?yàn)榘麅?nèi)多糖>發(fā)酵液純化多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液多糖，對(duì)羥基自由基清除能力大小順序?yàn)榘麅?nèi)多糖>發(fā)酵液多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液純化多糖。4種多糖樣品在4個(gè)指標(biāo)中以超氧陰離子自由基的EC50最小，清除率最高，差異性最小。發(fā)酵液多糖的DPPH自由基EC50最大，清除能力最弱，其次為發(fā)酵液純化多糖的羥基自由基EC50，其余組EC50也略有差異，但差異不顯著。從各個(gè)多糖樣品總還原力的RP0.5AU來(lái)看，抗氧化能力大小順序?yàn)榘麅?nèi)多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液純化多糖>發(fā)酵液多糖，可以明顯看出從發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中提取的多糖在總還原力指標(biāo)和抗氧化能力上顯著優(yōu)于發(fā)酵液提取的多糖。

表3 不同蟲(chóng)草多糖樣品抗氧化能力EC50和RP0.5 AU比較

3.11 細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果

由圖5a可知，在3.906～500 μg/mL范圍內(nèi)，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉胞內(nèi)及發(fā)酵液多糖細(xì)胞存活率隨多糖質(zhì)量濃度遞增先增大后減小。與空白組細(xì)胞相比可知，2種多糖對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，并且在31.25～125 μg/mL濃度范圍內(nèi)與空白組有顯著性差異。與LPS組相比，在31.25～125 μg/mL下兩種多糖樣品細(xì)胞存活率比LPS組高(P<0.01)，說(shuō)明這2種多糖會(huì)顯著性增大巨噬細(xì)胞的存活率，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖。

3.12 NO產(chǎn)生量測(cè)定結(jié)果

由圖5b可知，2種蟲(chóng)草多糖均隨質(zhì)量濃度的遞增而產(chǎn)生更多的NO，具有明顯的量效關(guān)系。2種蟲(chóng)草多糖樣品與空白組相對(duì)比，都能有效地增強(qiáng)細(xì)胞NO產(chǎn)生量。與LPS組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)多糖樣品產(chǎn)生NO的活性在3.906～500 μg/mL范圍內(nèi)低于LPS組，但從試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)趨勢(shì)來(lái)看，多糖樣品在高于500 μg/mL下可能會(huì)達(dá)到甚至超過(guò)LPS組產(chǎn)NO量；而相比之下，發(fā)酵液多糖的NO產(chǎn)生量更多，并且在大于250 μg/mL時(shí)與LPS組沒(méi)有顯著性差異，500 μg/mL時(shí)NO產(chǎn)生量?jī)?yōu)于LPS組，并且質(zhì)量濃度與NO產(chǎn)生量呈現(xiàn)明顯正相關(guān)趨勢(shì)。通過(guò)2種蟲(chóng)草多糖樣品對(duì)細(xì)胞NO產(chǎn)生量比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉胞外多糖產(chǎn)生NO的量要大于發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉胞內(nèi)多糖。

注：a圖中*表示與control組之間P<0.05；**表示與control組之間P<0.01。b圖中**表示與LPS組之間P<0.01；***表示與LPS組之間P<0.001。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)液體深層發(fā)酵工藝生產(chǎn)的發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及發(fā)酵液提取的多糖樣品進(jìn)行紫外和紅外光譜進(jìn)行分析，并對(duì)該菌株發(fā)酵生產(chǎn)不同來(lái)源提取的蟲(chóng)草多糖進(jìn)行活性比較。紫外光譜掃描結(jié)果表明4種多糖樣品都存在不同程度的核酸及蛋白質(zhì)殘留，簡(jiǎn)單的純化處理能大幅度降低多糖樣品中核酸及蛋白質(zhì)含量，且發(fā)酵液提取多糖尤其是發(fā)酵液純化多糖在260 nm和280 nm處無(wú)明顯核酸及蛋白質(zhì)吸收峰，相較于發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉提取多糖純度較高。紅外光譜掃描結(jié)果表明4種多糖樣品是以β-糖苷鍵連接且具有吡喃糖環(huán)的酸性雜多糖，純化后多糖有機(jī)質(zhì)含量降低。由蟲(chóng)草多糖樣品抗氧化能力指標(biāo)EC50和RP0.5 AU可知，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及發(fā)酵液提取的多糖均具有較好的抗氧化活性，且胞內(nèi)多糖抗氧化活性整體最高，ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基清除能力的EC50和總還原力的RP0.5 AU分別為0.75、2.12、0.13、1.77和156.30 mg/mL。在免疫活性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)這兩種不同來(lái)源提取多糖不僅能較好地促細(xì)胞增殖，還能增強(qiáng)細(xì)胞產(chǎn)NO的能力。