李春紅， 王 麗， 董玉龍， 李欣蕊， 楊 昊， 魏 鑫， 徐 彤

（1.河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院理學(xué)院，河北張家口 075000）

H9N2流感病毒屬于A型流感病毒，易使家禽和豬受到感染，同時也可感染人（殷斌等，2015；王斌和童光志，2012；Myers，2007）。1966年，從患有呼吸道疾病的火雞中分離出H9N2亞型禽流感病毒 （Homme和Easterday，1970）。H9N2亞型禽流感容易導(dǎo)致雞產(chǎn)蛋下降，與其他病原體混合感染而致雞的死亡率升高。流感病毒在豬體內(nèi)出現(xiàn)了混合感染的情況。Xu等（2004）從山東發(fā)病率和致死率較高的豬群中分離到了H9N2病毒。Peiris等證實(shí)中國東南地區(qū)豬群中存在H9N2禽流感和H3N2豬流感病毒。此外，H9N2流感病毒在禽類和豬群中不斷感染和傳播為流感病毒進(jìn)一步感染人 類 提 供 了 條 件 （Xu等 ，2018；Pan等 ，2018）。2016年四川省出現(xiàn)人感染H9N2流感病毒危重臨床病例的報道（Ninomiya等，2002）?？梢?，H9N2流感病毒引起的病毒性傳染病，嚴(yán)重威脅著公眾健康，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對H9N2流感病毒的研究具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食”的現(xiàn)象，是溶酶體對自身結(jié)構(gòu)的降解，釋放出游離小分子供細(xì)胞回收利用的正常動態(tài)生命過程，是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)。機(jī)體應(yīng)對外來病原微生物感染時啟動免疫應(yīng)答，細(xì)胞自噬在此發(fā)揮重要的作用（Kundu和Thompson，2008）。通過抑制自噬，在發(fā)生自噬的后期病毒免于被降解（Levine等，2011），抑制自噬可以促進(jìn)病毒粒子的生成和釋放。另有研究報道，自噬參與流感病毒的復(fù)制（Yeganeh等，2015；Zhou等，2009）。 在H9N2流感病毒感染的A549細(xì)胞中，抑制自噬后流感病毒的滴度和TCID50均顯著降低（Zhou等，2009）。細(xì)胞自噬到底是促進(jìn)病毒的自身復(fù)制還是清除細(xì)胞內(nèi)的病毒有待進(jìn)一步研究。MDCK細(xì)胞因其病毒生產(chǎn)效率高、快速增殖和低突變率而被認(rèn)為是生產(chǎn)流感病毒的有效宿主 （Merten等，1999；Taub等，1979）。因此本研究進(jìn)行了H9N2流感病毒誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞發(fā)生自噬及其對病毒復(fù)制影響的研究。

1 材料和方法

1.1 毒株與細(xì)胞H9N2流感病毒A/swine/Hebei/012/2008（H9N2）由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存；犬腎上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等常用細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購自浙江天杭生物科技有限公司；雷帕霉素（Rapamycin）、3-甲基腺嘌呤（3-MA） 購 自Sigma公 司 ；Polybrene和 嘌 呤 霉 素（Puromycin）均購自圣克魯斯生物公司；自噬標(biāo)記慢病毒（GFP-LC3）購自漢恒生物公司；總RNA提取試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自北京賽恩諾爾公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代MDCK細(xì)胞放于DMEM完全培養(yǎng)基中，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，選取符合試驗(yàn)要求的MDCK細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細(xì)胞。之后加入EDTA-胰酶約1 mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱消化0.5～1 min。待細(xì)胞瓶成霧狀時消化即可終止。收集處于分散均勻狀態(tài)的細(xì)胞，分裝至新的細(xì)胞瓶或者培養(yǎng)板備用。

1.4 MDCK細(xì)胞系的構(gòu)建與結(jié)果觀察

1.4.1 慢病毒感染細(xì)胞最適MOI值的確定MDCK細(xì)胞鋪96孔板，培養(yǎng)過夜。吸去培養(yǎng)好細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，隨后GFP-LC3慢病毒按MOI為1、5、10、20、40、100加入MDCK細(xì)胞中使其混合均勻。慢病毒感染細(xì)胞需要Polybrene的參與，隨即加入預(yù)先準(zhǔn)備好的Polybrene，終濃度為1.5 μg/mL。待感染MDCK細(xì)胞24 h后，需更換培養(yǎng)液。感染48 h后進(jìn)行熒光觀察，72 h后感染率80%左右，確定為MOI值。

1.4.2 GFP-LC3慢病毒感染MDCK接種24孔板培養(yǎng)過夜。感染前吸棄培養(yǎng)好細(xì)胞的培養(yǎng)基，更換新培養(yǎng)基，按1.4.1確定的MOI將慢病毒加入細(xì)胞中使其混勻。加入Polybrene，使其終濃度為1.5 μg/mL。慢病毒感染24 h，吸棄培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液。感染48 h，觀察GFP表達(dá)效率，更換含有終濃度為0.5 μg/mL Puromycin的新培養(yǎng)液。定時更換，使其Puromycin終濃度升至2.0 μg/mL。鎖定處于穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的MDCK細(xì)胞株，直至沒有受到慢病毒感染的細(xì)胞被全部處理掉。將獲得的MDCK細(xì)胞株命名為MDCK/GFP-LC3。

1.4.3 激光共聚焦觀察MDCK/GFP-LC3細(xì)胞鋪小皿，培養(yǎng)過夜后接種H9N2流感病毒，感染24 h后按常規(guī)洗滌方法處理，即可進(jìn)行激光共聚焦拍照分析影像資料。

1.5 病毒感染與藥物處理MDCK細(xì)胞預(yù)先經(jīng)H9N2流感病毒處理，MOI為2。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中作用1 h后經(jīng)PBS洗滌處理，繼續(xù)培養(yǎng)。待12、24 h和36 h時分別收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。H9N2流感病毒感染+藥物處理組：3-MA（終濃度為8 mM）作用MDCK細(xì)胞1 h后接種H9N2流感病毒，Rapamycin（終濃度為100 nM）作用MDCK細(xì)胞12 h接種H9N2流感病毒，使H9N2流感病毒在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中作用1 h后，用處理過的PBS洗滌，DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，感染后12、24、36 h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.6 細(xì)胞活性和TCID50的測定 參照CCK8試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。96孔板中每孔緩慢加入10 μL CCK8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)，二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 h后，檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光光度（OD）值。細(xì)胞存活率%＝（給藥組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。選取3-MA和Rapamycin兩種自噬劑，各給藥組按照預(yù)定的濃度梯度加入相應(yīng)的藥物。

按照常規(guī)方法檢測病毒的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量 （TCID50），用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR測定 按照RNAeasyTM病毒RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR測定。 測定在ABI 7300 system中進(jìn)行，20 μL體系，用內(nèi)參GAPDH處理，由2-△△Ct公式計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2007對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理；采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因子方差分析后進(jìn)行Tukey’s多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3 MDCK細(xì)胞系的鑒定研究報道，細(xì)胞自噬使LC3-II的合成顯著增加，LC3蛋白可被募集到自噬體膜上發(fā)生點(diǎn)狀聚集（Martinet等，2006；Kirisako等，1999）。 本試驗(yàn)激光共聚焦得出，MDCK/GFP-LC3細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色熒光，說明GFP-LC3在MDCK中穩(wěn)定表達(dá)（圖1），此結(jié)果將用于H9N2流感病毒感染后自噬發(fā)生的判斷。

圖1 激光共聚焦觀察GFP-LC3在MDCK細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 H9N2流感病毒感染MDCK/GFP-LC3后綠色熒光的點(diǎn)狀聚集 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光的點(diǎn)狀聚集，可作為檢測細(xì)胞自噬發(fā)生的方法（Mizushima等，2010）。本試驗(yàn)利用H9N2流感病毒感染MDCK/GFP-LC3細(xì)胞，激光共聚焦觀察MDCK/GFP-LC3綠色熒光的點(diǎn)狀聚集。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，對照組的綠色熒光呈現(xiàn)彌散的均勻分布 （圖2A），而H9N2流感病毒感染MDCK/GFP-LC3細(xì)胞24 h時棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，觀察到了綠色熒光的點(diǎn)狀聚集（圖2B）。由此得出，H9N2流感病毒感染MDCK/GFP-LC3細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。

圖2 H9N2流感病毒感染MDCK/GFP-LC3綠色熒光的點(diǎn)狀聚集

2.3 自噬抑制劑與自噬誘導(dǎo)劑對MDCK細(xì)胞生長活性的影響 利用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin對細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)控，檢測H9N2流感病毒感染MDCK細(xì)胞后自噬的發(fā)生對病毒復(fù)制的影響。以CCK8試劑盒檢測3-MA和Rapamycin對細(xì)胞活性的影響。

分 別 用20、40、100、160 nΜ 和220 nΜ 的Rapamycin處理MDCK細(xì)胞，結(jié)果如圖3A顯示，與空白對照組相比較，無論是低劑量Rapamycin處理組，還是高劑量Rapamycin處理組，細(xì)胞的活性均沒有顯著差異（P＞0.05）。分別用2、4、8、16 mM和24 mM 3-MA處理MDCK細(xì)胞，結(jié)果如圖3B顯示，與空白對照組相比較，無論是低劑量3-MA處理組，還是高劑量3-MA處理組，細(xì)胞的活性均沒有明顯變化（P＞0.05）。因此，給定濃度的自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin和自噬抑制劑3-MA處理MDCK細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞的活性均沒有呈現(xiàn)明顯的變化。

圖3 CCK8檢測Rapamycin和3-MA對MDCK細(xì)胞活性的影響

2.4 自噬促進(jìn)劑對H9N2流感病毒增殖的影響為進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬對于H9N2流感病毒復(fù)制的影響，利用Rapamycin誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，檢測NP的mRNA水平以及病毒的滴度。結(jié)果如圖4所示，Rapamycin處理MDCK細(xì)胞后，接種H9N2流感病毒，可以顯著增加NP的mRNA水平和病毒滴度（P＜0.01）。因此，Rapamycin在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬方面發(fā)揮了重要的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可以促進(jìn)H9N2流感病毒的增殖，細(xì)胞自噬參與H9N2流感病毒復(fù)制的過程。

圖4 Rapamycin對于NP mRNA水平和病毒滴度的影響

2.5 自噬抑制劑對H9N2流感病毒增殖的影響為探討細(xì)胞自噬是否參與H9N2流感病毒復(fù)制的過程，利用3-MA處理MDCK細(xì)胞，接種H9N2流感病毒，分析NP的mRNA水平，結(jié)果如圖5所示，與H9N2流感病毒感染組相比，3-MA處理MDCK細(xì)胞后，接種H9N2流感病毒后的12、24 h和36 h均能顯著降低NP的mRNA水平和病毒滴度（P＜0.01）?？梢姡?-MA在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬方面發(fā)揮了重要的作用，抑制細(xì)胞自噬阻礙H9N2流感病毒復(fù)制，細(xì)胞自噬參與H9N2流感病毒復(fù)制的過程。

圖5 3-MA對于NP mRNA水平和病毒滴度的影響

3 討論

病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是一種常見的自噬形式。自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)沒有用處的物質(zhì)，也可以清除細(xì)胞內(nèi)受感染的細(xì)菌和病毒。然而有研究認(rèn)為在流感病毒感染細(xì)胞后，流感病毒能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制自噬體與溶酶體融合，自噬體在細(xì)胞內(nèi)積累，阻止了病毒抗原呈遞，促使病毒復(fù)制，因此對細(xì)胞有害對病毒有利。然而有研究證實(shí)在流感病毒感染的細(xì)胞中，抑制自噬導(dǎo)致在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中流感病毒的滴度顯著降低。

基于上述前人研究結(jié)果，本研究利用自噬抑制劑3-MA抑制細(xì)胞自噬，實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示NP的mRNA的水平顯著降低，TCID50結(jié)果顯示病毒的滴度顯著降低，說明抑制細(xì)胞自噬可以降低H9N2流感病毒的復(fù)制。進(jìn)而本研究利用自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，實(shí)時定量PCR顯示NP的mRNA的水平顯著升高，TCID50結(jié)果顯示病毒的滴度也顯著上升，說明誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可以促進(jìn)流感病毒的復(fù)制。

在生物進(jìn)化過程中，自噬已經(jīng)發(fā)展成為生物體內(nèi)一種必不可少的細(xì)胞機(jī)制。在MDCK細(xì)胞中，細(xì)胞自噬可以促進(jìn)流感病毒的復(fù)制，提示細(xì)胞自噬參與H9N2流感病毒的致病機(jī)理。

4 結(jié)論

在MDCK細(xì)胞中，自噬抑制劑可以降低NP的mRNA水平以及病毒的滴度，抑制自噬可降低H9N2流感病毒的復(fù)制。自噬促進(jìn)劑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，NP mRNA的表達(dá)水平增加以及病毒的滴度也上升，可以促進(jìn)H9N2流感病毒的復(fù)制。