鄧 俊， 劉藝端， 許文坤， 孫利民， 戚 敏

（云南省畜牧總站，云南昆明 650225）

我國(guó)是世界上豬遺傳資源最為豐富的國(guó)家之一，地方豬種資源的數(shù)量已達(dá)到108個(gè)，在世界種質(zhì)資源中的占比達(dá)到1/3左右 （魏菁等，2021），而隨著國(guó)外良種豬品種的大量引入以及與地方豬種進(jìn)行雜交，導(dǎo)致地方優(yōu)良豬種種質(zhì)資源在逐漸下降，因此保護(hù)地方豬種種質(zhì)資源也成為一項(xiàng)重要工作（陳清森等，2012）。撒壩豬產(chǎn)于云南海拔2000 m左右昆明和楚雄一帶，中心地處祿勸縣撒壩，得名撒壩豬，具有耐粗飼、產(chǎn)仔性能好、肉質(zhì)優(yōu)良、雜交利用經(jīng)濟(jì)性能好等優(yōu)點(diǎn) （張偉力等，2013；趙中保等，2005），是云南省9個(gè)經(jīng)國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)鑒定的地方豬品種（遺傳資源）之一，是我國(guó)重要的地方種質(zhì)遺傳資源（袁躍云等，2015）。

一個(gè)物種（或群體）不同個(gè)體（或染色體）之間的DNA水平上的差異稱為遺傳多樣性，一般指種內(nèi)個(gè)體之間或者一個(gè)物種（或群體）內(nèi)的不同個(gè)體（或染色體）之間的DNA差異的總和，因此也稱種內(nèi)的遺傳多樣性（Ellegren等，2016）。遺傳多樣性有助于一個(gè)物種 （或群體）對(duì)環(huán)境的變化作出適應(yīng)，物種遺傳多樣性與環(huán)境的適應(yīng)性呈正相關(guān)關(guān)系（Ellegren等，2016）；群體內(nèi)的遺傳多樣性水平會(huì)影響該重點(diǎn)群體的生產(chǎn)力、數(shù)量增長(zhǎng)和穩(wěn)定性，對(duì)一個(gè)物種（或群體）進(jìn)行遺傳多樣性分析，對(duì)該物種（或群體）的保護(hù)、恢復(fù)和在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用具 有 重 要 意 義 （Dewoody等 ，2021；Hughes等 ，2010）。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組中單個(gè)核苷酸因堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失所引起的，SNP標(biāo)記技術(shù)是基于高通量測(cè)序和DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)芯片在分子水平上對(duì)遺傳物質(zhì)的變異發(fā)生反應(yīng)標(biāo)記，能對(duì)遺傳物質(zhì)的變異具有更精準(zhǔn)的辨別，具有廉價(jià)、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)（陳星等，2019）。現(xiàn)階段，SNP技術(shù)已用于人類疾病診斷（Weedon等，2021）、構(gòu)建家犬遺傳圖譜（Dreger等，2016）、家畜遺傳結(jié)構(gòu)分析（蔡春波等，2021；蘭蓉等，2019）等方面，運(yùn)用SNP技術(shù)對(duì)家畜保種工作提供了更加便捷的技術(shù)手段。本研究利用“京芯一號(hào)”SNP芯片從分子水平分析撒壩豬保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)變化以及遺傳多樣性，拓寬遺傳背景，指導(dǎo)和促進(jìn)撒壩豬的保種工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用撒壩豬樣本來(lái)源于楚雄州種豬種場(chǎng)，共100頭，其中37頭公豬，合計(jì)63頭母豬。

1.1.2 SNP芯片 “京芯一號(hào)”SNP芯片來(lái)源于北京康普森生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 撒壩豬保種群體基因組DNA的提取 對(duì)100頭豬進(jìn)行耳靜脈采血，血液樣品均勻涂在血液采集卡的點(diǎn)樣圈內(nèi)，自然陰涼至完全干燥，至實(shí)驗(yàn)室使用Magbead Blood Spots DNA Kit磁珠法血卡DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 撒壩豬保種群體基因組DNA分型與質(zhì)控使用“中芯一號(hào)”芯片對(duì)DNA樣本進(jìn)行SNP基因分型，100頭撒壩豬保種群體中共檢測(cè)到51315個(gè)SNPs位點(diǎn)，分析之前使用Plink（V1.90）軟件對(duì)SNPs位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，只保留分型質(zhì)量最好的位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析，通過(guò)質(zhì)量控制的SNPs數(shù)目為42986個(gè)。根據(jù)不同分析的需要進(jìn)行再次質(zhì)控，具體分析項(xiàng)目的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及剩余SNPs數(shù)目見(jiàn)表1。

表1 具體分析項(xiàng)目的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與剩余SNPs數(shù)目

2 結(jié)果與分析

2.1 撒壩豬保種群體遺傳多樣性分析 撒壩豬保種群體遺傳多樣性分析主要包括有效群體含量（Ne）分析、群體的多態(tài)性標(biāo)記比例（PN）分析、群體的期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）分析。撒壩 豬 保 種 群 體 的Ne為21，PN為0.533，He為0.263，Ho為0.275。

2.2 撒壩豬保種群體基因組親緣關(guān)系分析 利用SNP位點(diǎn)構(gòu)建的基因組關(guān)系G矩陣可以進(jìn)一步分析撒壩豬保種群體的親緣關(guān)系，撒壩豬保種群體公畜與母畜之間基因組親緣關(guān)系系數(shù)介于-0.2251～0.7798，平均基因組親緣關(guān)系系數(shù)為（0.009±0.1351）?？梢暬Y(jié)果如圖1所示，該撒壩豬保種群體按照親緣關(guān)系出現(xiàn)多個(gè)家系，部分個(gè)體之間親緣關(guān)系值較大，說(shuō)明部分個(gè)體之間存在近交問(wèn)題。

圖1 撒壩豬親緣關(guān)系分析可視化結(jié)果圖

2.3 撒壩豬群體家系構(gòu)建 本次研究使用鄰接法（NJ），基于IBS遺傳距離分析結(jié)果對(duì)樣本進(jìn)行聚類。鑒于公豬對(duì)于整個(gè)保種群體的重要性，將公豬樣本提取出來(lái)單獨(dú)做了聚類分析，聚類結(jié)果如圖2所示，將現(xiàn)100頭撒壩豬保種群體中37頭公豬劃分為A～G 7個(gè)家系，根據(jù)與不同家系公豬親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度，將63頭母豬劃分進(jìn)上面已構(gòu)建的7個(gè)公豬家系中，結(jié)果見(jiàn)表2。該撒壩豬保種群體構(gòu)建家系中家系C與家系F個(gè)體數(shù)量最少，公畜有且僅有1頭，應(yīng)當(dāng)著重對(duì)這兩個(gè)家系進(jìn)行保護(hù)，保證家系多樣性，防止保種群體家系進(jìn)一步減少。

表2 撒壩豬群體家系構(gòu)建結(jié)果

圖2 撒壩豬公豬樣本聚類分析結(jié)果圖

2.4 撒壩豬基于ROH的近交系數(shù)分析 在100頭撒壩豬保種群體中，共檢測(cè)到3552個(gè)ROH，長(zhǎng)度在8.20～621.32 Mb，每頭撒壩豬含有ROH在2～53個(gè)，如圖3所示，其中含有35～40個(gè)ROH個(gè)體數(shù)量最多，且含有25～45個(gè)ROH個(gè)體數(shù)量占種群數(shù)量的87%。如圖4所示，該撒壩豬保種群體在ROH總長(zhǎng)度為250～300 Mb的個(gè)體數(shù)量占比最大，且平均個(gè)體ROH長(zhǎng)度為（319.38±111.39）Mb。該撒壩豬保種群體基于ROH的近交系數(shù)（FROH）平均為0.130，如圖5所示，該撒壩豬保種群體FROH的中位數(shù)大于0.125，F(xiàn)ROH的上四分位數(shù)和下四分位數(shù)介于0.100～0.175，且該撒壩豬保種群體中在FROH為0.100～0.150的數(shù)量最多。

圖3 撒壩豬個(gè)體ROH數(shù)量的分布圖

圖4 撒壩豬ROH長(zhǎng)度分布圖

圖5 撒壩豬基于ROH的近交系數(shù)FROH的分布

3 討論

動(dòng)物保種的主要目的是最大限度地減少近交衰退，避免其他品種血緣的雜化，同時(shí)保證種群的遺傳多樣性。有效群體含量（Ne），是指在一個(gè)理想群體中，在隨機(jī)遺傳漂變影響下，能夠產(chǎn)生相同的等位基因分布或者等量的同系繁殖的個(gè)體數(shù)量，而理想群體是指規(guī)模恒定、公母各半、沒(méi)有選擇、遷移、突變，也沒(méi)有世代交替的隨機(jī)交配群體（任憲云，2011；Wright，1931）。Ne值可以根據(jù)群體的連鎖不平衡 （LD）值進(jìn)行估算 （Barbato等，2015），且Ne值與LD值呈反比關(guān)系 （Soule等，1980），Ne值過(guò)小，說(shuō)明這個(gè)群體LD值過(guò)大，從而該群體在進(jìn)化過(guò)程中可能很少發(fā)生遷移、突變、選擇等遺傳變異（羅元宇，2016），一般情況下，當(dāng)群體Ne值大于等于50時(shí)，能夠避免近交衰退，確保群體短期內(nèi)的生存能力 （Lander等，1994）。本研究中撒壩豬保種群體的Ne為21，說(shuō)明該保種群體比較封閉，遺傳變異較小，存在著較高程度的近交現(xiàn)象，為此，需要積極引入本品種新血緣，防止種群因近交衰退。群體中多態(tài)的位點(diǎn)與總位點(diǎn)的比值稱為多態(tài)性標(biāo)記比例（PN），該撒壩豬保種群體PN值為0.533，說(shuō)明該保種群體多態(tài)性位點(diǎn)的比例較高。觀察雜合度（Ho）由觀察到的某一位點(diǎn)雜合子個(gè)體數(shù)與總個(gè)體數(shù)之間的比值得出，是指隨機(jī)抽取的兩個(gè)樣本的等位基因不相同的概率，期望雜合度是根據(jù)年提出的公式計(jì)算得出的理想期望值 （Nei，1978）。該撒壩豬保種群體He為0.263、Ho為0.275，觀察雜合度（Ho）高于期望雜合度（He）的值，說(shuō)明該保種群體曾經(jīng)可能引進(jìn)了非撒壩豬的外來(lái)血緣，需要進(jìn)一步保證純化度。

G矩陣是基于VanRaden（2008）提出的使用全基因組標(biāo)記構(gòu)建基因組關(guān)系矩陣的方法。鑒于保種群體的系譜信息通常是缺失比較嚴(yán)重，因此在標(biāo)記密度合適的情況下，G矩陣能更真實(shí)的反映個(gè)體間的關(guān)系，它相對(duì)于單純根據(jù)系譜信息進(jìn)行的親緣關(guān)系分析結(jié)果，更加準(zhǔn)確和接近實(shí)際情況判斷保種群體的親緣關(guān)系，基因組親緣關(guān)系系數(shù)（Grelation）介于-1～1，越接近1，說(shuō)明兩個(gè)個(gè)體親緣關(guān)系越近。該撒壩豬保種群體平均基因組親緣關(guān)系系數(shù)為（0.009±0.1351），說(shuō)明大部分個(gè)體親緣關(guān)系呈中等程度，存在較大的潛在近交風(fēng)險(xiǎn)，要進(jìn)一步強(qiáng)化選配措施，理論上公畜應(yīng)優(yōu)先與親緣關(guān)系遠(yuǎn)的個(gè)體進(jìn)行交配，即與基因組親緣關(guān)系系數(shù)低的母畜進(jìn)行交配。

基因組長(zhǎng)純合片段（ROH）是親代在傳代過(guò)程中產(chǎn)生的純合基因型連續(xù)片段，在所有群體中均廣泛存在。ROH的長(zhǎng)度和頻率可以反映群體親緣關(guān)系歷史，長(zhǎng)ROH片段數(shù)量和家系內(nèi)近交的可能性呈正比，數(shù)量越多，近交的可能性越大（Zhang等，2018）。該撒壩豬保種群體ROH片段長(zhǎng)，平均個(gè)體ROH長(zhǎng)度為（319.38±111.39）Mb，高于青峪豬（劉彬等，2020）平均（131.39±121.33）Mb的ROH長(zhǎng)度，也高于藍(lán)塘豬（王晨等，2018）平均（240.90±170.93）Mb的ROH長(zhǎng)度，且該撒壩豬保種群體基于ROH的近交系數(shù)（FROH）平均為0.130，中位數(shù)大于0.125，該撒壩豬保種群體平均近交系數(shù)近似在遺傳學(xué)中（FROH）為1/8（0.125）叔侄交，從以上數(shù)據(jù)表明，該撒壩豬保種種群存在近交現(xiàn)象，需要進(jìn)一步加強(qiáng)保種，防止近交衰退。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)撒壩豬分子水平上群體遺傳的研究，發(fā)現(xiàn)該保種撒壩豬群體內(nèi)家系數(shù)量適中，個(gè)別家系公畜數(shù)量較少，各家系個(gè)體數(shù)差異明顯，群體中可能存在非撒壩豬的外來(lái)血緣，個(gè)體親緣關(guān)系呈中等程度，近交程度較高，需要進(jìn)行合理選配或者從原種場(chǎng)引入新的血統(tǒng)等方式來(lái)確保撒壩豬遺傳資源的多樣性。