羅愛勤， 曹穎男， 鐘春燕

（廣州新華學(xué)院，廣東廣州 510520）

藍(lán)刺頭是菊科植物藍(lán)刺頭 （Echinops Latifolius Tausch.）的干燥頭狀花序，被列入衛(wèi)生部蒙藥分冊(cè)中，有苦、稀、輕、軟、鈍、涼等藥性（國家藥典委員會(huì)，1998）。張勇等（2018）和巴音額古樂等（2015）研究證實(shí)，藍(lán)刺頭可以穩(wěn)固骨骼、接骨愈傷、退熱止痛，用于治療骨折、骨熱、刺痛、瘡瘍等癥。劉巖等（2017）研究表明，藍(lán)刺頭可以降低血清骨鈣素（BGP）水平，因其具有類雌激素樣活性作用，能上調(diào)去卵巢大鼠ERα和ERβ的表達(dá)，從而促進(jìn)骨骼形成，調(diào)節(jié)骨骼吸收與骨形成的偶聯(lián)，降低骨轉(zhuǎn)化速率，減小骨缺失，可有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。王佳琪等（2018）研究藍(lán)刺頭等化學(xué)成分，并從中分離得黃酮類化合物，謝友良等（2019）對(duì)藍(lán)刺頭化學(xué)成分的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述，表明其主要黃酮類化合物為芹菜素及其苷。芹菜素具有明顯的雌激素樣活性作用，巴音額古樂等（2015）、寇詠梅（2013）和朱瑞清（2012）研究表明，芹菜素發(fā)揮雌激素樣活性作用的信號(hào)通路與雌激素活性信號(hào)通路不完全一樣，B環(huán)位置是雌激素樣活性作用的一個(gè)重要位點(diǎn)。因此，總黃酮、芹菜素及其苷是藍(lán)刺頭中重要的藥理活性成分，本文研究了藍(lán)刺頭中總黃酮的富集工藝過程，旨在為藥用植物藍(lán)刺頭的開發(fā)應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，藍(lán)刺頭在內(nèi)蒙也作為畜牧料草使用，對(duì)藍(lán)刺頭的深入研究也能促進(jìn)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)牧業(yè)發(fā)展。

1 儀器和材料

1.1 儀器BS210S電子天平 （德國Sartorius）、UV-2550紫外分光光度計(jì)（島津）、KQ-400GKDV超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲波設(shè)備有限公司）

1.2 材料 芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品 （≥98.0%，批號(hào)C12209806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海銘博生物科技有限公司），藍(lán)刺頭藥材（保定仙德中藥銷售公司，批號(hào)100210301，經(jīng)廣州新華學(xué)院藥學(xué)院鑒定系菊科植物藍(lán)刺頭的干燥頭狀花序），大孔樹脂D101、AB-8、X-5、HPD-400、NKA-9（天津南大樹脂科技有限公司），其他試劑（分析純），純化水。

2 方法和結(jié)果

2.1 紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取適量芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，裝入10 mL量瓶中，加入60%乙醇，制成每毫升含有芹菜苷0.328 mg的溶液，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL， 分 別 裝 入10 mL量瓶中，加入5%三氯化鋁溶液3 mL，然后加入60%乙醇至刻度，充分搖動(dòng)后靜置30 min。采用紫外-可見分光光度法測(cè)定（中國藥典2020年版四部通則0401），在波長275 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（國家藥典委員會(huì)，2020）。所得回歸方程為Y＝0.0357X-0.0065，r＝0.99994。 結(jié)果顯示，芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品在3.28～32.8 μg/mL與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 測(cè)定法 精密吸取樣品溶液1.0 mL，裝入10 mL測(cè)量瓶中，加入5%三氯化鋁溶液3 mL，再加入60%乙醇至刻度，充分振蕩后放置30 min。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，依法測(cè)量吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品溶液中所包含的芹菜苷量（μg），計(jì)算，即得。

2.2 上樣液的制備 取適量藍(lán)刺頭（粉碎），用10倍55%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并55%乙醇提取液，回收乙醇并濃縮至適量，加水使稀釋至藥材量的10倍，于4000 r/min離心分離10 min，取出上清液，即得。

2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 按照蘭海等 （2020）的試驗(yàn)方法，將大孔吸附樹脂用水浸泡3次，20 min/次，過濾，用乙醇煮沸30 min，過濾，再用乙醇浸泡24 h，備用。

2.4 樹脂型號(hào)篩選 利用靜態(tài)吸附試驗(yàn)，確定大孔樹脂的比吸附量和解吸量，篩選出最佳樹脂類型。 取D101、AB-8、X-5、HPD-400和NKA-9大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，稱取2 g處理后的樹脂分別裝入不同錐形瓶中，加入50 mL樣品溶液（含總黃酮5 mg/mL），靜態(tài)吸附24 h，吸附平衡后，過濾，向吸附溶液中加水至50 mL，測(cè)定溶液中總黃酮量，計(jì)算吸附量（吸附量＝樣品溶液總黃酮量-吸附后溶液中總黃酮量）和比吸附量（比吸附量＝吸附量/樹脂量），結(jié)果如表1所示。

表1 大孔樹脂對(duì)藍(lán)刺頭溶液中總黃酮的靜態(tài)吸附

取吸附后的樹脂，用純化水浸泡2次（100 mL、30 min/次），濾干，向樹脂中加入100 mL 80%乙醇，靜態(tài)吸附24 h，過濾，取濾液，加入80%乙醇，定容為100 mL，測(cè)定80%乙醇溶液中總黃酮量（即解吸量），計(jì)算比解吸量（比解吸量＝解吸量/樹脂量）和解吸率（解吸率＝解吸量/吸附量），結(jié)果見表2。

新生兒氣胸常并發(fā)新生兒濕肺、新生兒肺炎、新生兒吸入綜合征，嚴(yán)重影響新生兒生活質(zhì)量。因此，及時(shí)診斷并治療新生兒氣胸對(duì)改善其預(yù)后有著較為重要的作用[3-4]。

表2 吸附后大孔樹脂對(duì)藍(lán)刺頭總黃酮的靜態(tài)解吸

從表1和表2結(jié)果中可以清楚地看出，不同極性的大孔樹脂對(duì)藍(lán)刺頭總黃酮具有一定的吸附作用，其中，D101、AB-8和X-5大孔樹脂對(duì)藍(lán)刺頭總黃酮的吸附作用明顯強(qiáng)于HPD-400和NKA-9大孔樹脂，AB-8大孔樹脂的吸附性能最佳。D101大孔樹脂的解吸能力較其他類型的樹脂要弱，其他大孔樹脂可以完全解吸藍(lán)刺頭總黃酮。因此，綜合考慮吸附和解吸，選擇AB-8大孔樹脂進(jìn)行下一步研究。

2.5 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)研究

2.5.1 藍(lán)刺頭上樣液濃度對(duì)大孔樹脂比吸附量的影響 按2.2.1項(xiàng)下方法，制備總黃酮含量為3.01、4.23、5.17、6.04、7.18 mg/mL的藍(lán)刺頭上樣液各300 mL，取AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后分成5份，每份15.50 g，分別加入上述上樣液中，然后進(jìn)行靜態(tài)吸附，分別于靜態(tài)吸附1、2、3、4、5、6、7、8、10 h后取樣，測(cè)定取樣液中總黃酮量，結(jié)果見表3。

表3 藍(lán)刺頭上樣液濃度對(duì)AB-8大孔樹脂比吸附量的影響

從表3中可以看出，隨著吸附時(shí)間的延長，AB-8大孔樹脂對(duì)不同濃度藍(lán)刺頭上樣液的比吸附量逐漸增加；大孔樹脂吸附1 h后對(duì)初始含量為6.04 mg/mL的藍(lán)刺頭上樣液的比吸附量要比其他濃度上樣液的高，但吸附時(shí)間大于1 h后，樹脂對(duì)該濃度上樣液的比吸附量的增加幅度小于其他濃度上樣液，表明AB-8大孔樹脂可以在短時(shí)間內(nèi)從初始含量為6.04 mg/mL的藍(lán)刺頭上樣液中吸附總黃酮，達(dá)到基本飽和。

2.5.2 最大上樣體積的考察 將AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，稱取12.5 g濕法裝柱（φ=1cm徑高比1：8），取總黃酮量6.04 mg/mL的藍(lán)刺頭上樣液200 mL加入樹脂柱中，收集流出液（10 mL/管），分別檢測(cè)累積流出液中總黃酮量，結(jié)果見表4。

表4 累積流出液中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

由表4可知，累積流出液達(dá)到150 mL以上時(shí)，從流出液中檢測(cè)出總黃酮，表明有總黃酮泄露，累積體積157 mL為總黃酮含量的拐點(diǎn)，因此對(duì)總黃酮含量為6.04 mg/mL的藍(lán)刺頭上樣液，其上樣體積不宜超過150 mL。

2.5.3 上樣液吸附速度對(duì)樹脂比吸附量的影響取AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，稱量9.65 g濕法裝柱，再取總黃酮含量6.04 mg/mL的藍(lán)刺頭上樣液300 mL， 分別以每小時(shí)0.5、1、1.5、2、2.5倍樹脂柱體積的速度進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，然后用純化水以2 BV/h的速度進(jìn)行清洗除雜，收集流出液，測(cè)定流出液中總黃酮量，計(jì)算樹脂比吸附量，結(jié)果見表5。

表5 上樣速度對(duì)比吸附量的影響

由表5結(jié)果可看出，在0.5 BV/h和1.0 BV/h上樣吸附速度下，AB-8大孔樹脂對(duì)上樣液的比吸附量高于其他速度，而0.5 BV/h和1.0 BV/h的上樣速度下，樹脂的比吸附量沒有明顯差異，但是上樣速度慢，吸附時(shí)間長。

圖1 不同徑高比AB-8大孔吸附樹脂對(duì)藍(lán)刺頭總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附和解吸效果比較

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.6.1 試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)研究結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平（表6），運(yùn)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的基本原理，按照張沛等（2021）和牛鶴麗（2021）的試驗(yàn)方法，進(jìn)行了RSM分析試驗(yàn)，按表8分別使用AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附藍(lán)刺頭上樣液后，以純化水4 BV進(jìn)行除雜（2 BV/h），然后用80%乙醇4 BV進(jìn)行洗脫 （1 BV/h），接收80%乙醇洗脫液，回收溶劑并干燥得干膏，測(cè)定干膏中總黃酮的含量，以考察上樣液濃度（A）、上樣速度（B）和樹脂徑高比（C）對(duì)純化后所得干膏中總黃酮含量（Y）的影響，結(jié)果見表7。

表6 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 響應(yīng)曲面方差分析 通過多元回歸對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)進(jìn)行了模擬，以總黃酮含量為目標(biāo)函數(shù)，得出了各參數(shù)水平的多元二次方程：Y＝65.90+0.0875A+0.3375B-0.275C-0.6AB-0.325AC-0.075BC-4.23A2-2.38B2-2.40C2，對(duì)此進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果如表8所示。

表8 響應(yīng)面方差分析

從表8中可以看出，該回歸模型P＜0.01表示二次回歸方程的模型顯著，失擬項(xiàng)P＝0.0716＞0.05表示該回歸方程的擬合度高，誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，模型可靠，R2＝0.9745表明模型可充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，與鄧佑林等（2021）的試驗(yàn)結(jié)果一致。在所有影響因子中，僅二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)總黃酮含量的變化影響極顯著 （P＜0.01）。從表中F值可知，各因素對(duì)總黃酮純化影響大小順序?yàn)椋荷蠘铀俣龋˙）＞樹脂徑高比（C）＞上樣液濃度（A）。

2.6.3 兩因素間的交互作用 不同因素相互作用影響總黃酮含量的響應(yīng)曲面如圖2所示。李慧敏等（2018）的研究表明，曲面越陡，表示該因素對(duì)總黃酮含量的影響越大。從圖2可以清晰地看出，總黃酮含量的三個(gè)響應(yīng)曲面均開口朝下，與三個(gè)影響因子均有明顯的二次拋物關(guān)系，上樣液濃度、上樣液吸附速度和樹脂徑高比不斷增加，總黃酮含量逐漸升高，并出現(xiàn)極大值，隨后呈不同斜率的下降，另從方差分析結(jié)果與響應(yīng)曲面觀察可知，AB曲線變化最為密集陡峭，其次為AC，影響最小為BC。對(duì)二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行了極值分析，得到的AB-8大孔樹脂純化藍(lán)刺頭總黃酮的最優(yōu)工藝條件為：藍(lán)刺頭上樣液總黃酮量6 mg/mL，樹脂徑高比1：8，上樣液吸附速度1 BV/h，洗脫溶劑80%乙醇，純化后總黃酮理論含量為63.9%，實(shí)際含量達(dá)65%以上，與模型預(yù)測(cè)值較接近。

圖2 兩因素交互影響總黃酮含量的響應(yīng)曲面

2.7 乙醇洗脫液濃度的考察 將AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，稱取3份（10 g/份），濕法裝柱（φ＝1 cm徑高比1：8），再取6.04 mg/mL藍(lán)刺頭上樣液3份（150 mL/份），分別動(dòng)態(tài)吸附（1 BV/h），接著用純化水4 BV除雜 （2 BV/h），然后分別使用70%、80%、95%乙醇4 BV洗脫（1 BV/h），分別接收水洗液和各濃度乙醇洗脫液，測(cè)定其中總黃酮，計(jì)算吸附量、比解吸量和解吸率，將各濃度乙醇洗脫液濃縮并干燥得干膏，稱量干膏重，并測(cè)定干膏中總黃酮含量，結(jié)果如表9所示。

表9 不同濃度乙醇溶液的洗脫情況

從表10結(jié)果可知，80%和95%乙醇均能將樹脂所吸附的總黃酮完全解吸，但是95%乙醇洗脫所得的干膏純度較低。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 取已處理的AB-8大孔樹脂3份（10 g/份），濕法裝柱（φ＝1 cm徑高比1：8），再取6.04 mg/mL藍(lán)刺頭上樣液3份（150 mL/份），分別動(dòng)態(tài)吸附（1 BV/h），接著用純化水4 BV除雜（2 BV/h），然后用80%乙醇4 BV洗脫（1 BV/h），接收水洗液和80%乙醇洗脫液，測(cè)定其中總黃酮，計(jì)算吸附量、比解吸量和解吸率，將80%乙醇洗脫液經(jīng)過濃縮后進(jìn)行蒸干，得到干膏，稱量干膏重量，測(cè)定干膏中總黃酮含量，結(jié)果如表10所示。從表10結(jié)果可知，該工藝條件純化所得的藍(lán)刺頭總黃酮含量達(dá)65%以上，且工藝重復(fù)性良好。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)中在芹菜苷對(duì)照品溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉試劑，結(jié)果無紅色物質(zhì)產(chǎn)生，在500 nm處也無吸收，說明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法并不適用藍(lán)刺頭總黃酮的測(cè)定。李蓮芳等（2017）利用結(jié)構(gòu)中含5-羥基、4-羰基的黃酮類化合物能與三氯化鋁反應(yīng)形成絡(luò)合物的原理來測(cè)定大棗中總黃酮的含量；芹菜苷結(jié)構(gòu)中也含相同結(jié)構(gòu)，能使帶I或帶II向紅位移；帶II紅移后對(duì)照品溶液與供試品溶液在（275±2）nm處有共同吸收峰，因而可以用三氯化鋁作為顯色劑測(cè)定藍(lán)刺頭總黃酮的含量。目前，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道采用三氯化鋁比色法測(cè)定植物中的總黃酮含量（孟憲琦等，2021；黃艷萍等，2021；張國權(quán)等，2018；劉云鶴等，2017），主要因?yàn)槿然X顯色法測(cè)定總黃酮結(jié)果在誤差范圍內(nèi)準(zhǔn)確度較高，顯色反應(yīng)時(shí)黃酮類物質(zhì)反應(yīng)較強(qiáng)，而對(duì)色素、酚酸等非黃酮類物質(zhì)的反應(yīng)極弱，因而對(duì)黃酮類化合物的專屬性較強(qiáng)。本研究中利用三氯化鋁與5-羥基、4-羰基的黃酮或黃酮醇類化合物反應(yīng)生成絡(luò)合物使帶II向紅位移的原理測(cè)定藍(lán)刺頭總黃酮的含量，測(cè)定法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度較好。

大孔樹脂已被廣泛使用，主要用于進(jìn)行自然界化合物的分離、富集，如糖苷及其他糖類的分離，在多糖、黃酮類、三萜類和生物堿等化合物的分離精制中，存在著許多的應(yīng)用案例。藍(lán)刺頭中的總黃酮如芹菜素、芹菜苷，其結(jié)構(gòu)中主要含有5，3’-二羥基，易被大孔樹脂直接吸附，不能直接用水洗脫，只能用一定濃度的乙醇溶液洗脫。因此，純化藍(lán)刺頭總黃酮時(shí)，可以用純化水去除一些高極性雜質(zhì)，如糖、蛋白和黏液質(zhì)，以無色洗脫液為終點(diǎn)，判斷洗脫去除雜質(zhì)的效果。水洗后用高濃度乙醇為洗脫劑，收集所要富集的總黃酮類成分。

本研究共選取了5種不同類型的大孔樹脂，分別考察了它們的吸附性能和解吸特性，選取了性能最佳的AB-8大孔樹脂用于藍(lán)刺頭總黃酮的純化。此外，研究過程中考察了藍(lán)刺頭上樣液的濃度及其最大上樣體積、上樣液吸附的速度和樹脂徑高比等因素對(duì)樹脂吸附藍(lán)刺頭總黃酮能力的影響，以及總黃酮純化效果的影響，并篩選出最佳工藝條件。利用最佳工藝純化后的藍(lán)刺頭總黃酮的含量超過65%，表明純化效果良好，本研究為藍(lán)刺頭的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。