李 婷 黃小園 馬 鳳 廖承浩 王 凱

（1 杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，杭州 311399；2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310006；3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310009）

脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是革蘭陰性菌內(nèi)毒素，為引起炎癥的病原模式相關(guān)分子（pathogen associated molecular pattern， PAMP），可與Toll 樣受體4（Toll like receptor 4， TLR4）特異性結(jié)合，激活炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1]。白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）主要由CD4+T細(xì)胞亞群分化形成Th17細(xì)胞后所分泌的炎癥因子[2]，在自身免疫病和慢性炎癥中作為驅(qū)動(dòng)因素受到關(guān)注[3]。

LPS刺激可促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生[4-5]。在妊娠期間接觸病毒所引發(fā)的IL-17相關(guān)的母體免疫應(yīng)答，會(huì)增加后代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的風(fēng)險(xiǎn)，如自閉癥[6]。干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor 3，IRF3）是轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)干擾素β（interferon-β，IFN-β）的產(chǎn)生，從而抵抗病毒感染[7]。在不同的刺激條件下，IRF3還可以促進(jìn)IL-6、CXCL9、CXCL10和CCL5等炎癥因子的產(chǎn)生[7-10]。本研究針對(duì)IL-7產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了初步檢測(cè)，探討LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后IRF3對(duì)IL-17表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑

C57BL/6野生型小鼠和IRF3基因敲除小鼠飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，取6～8周齡雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3% 巰基乙酸肉湯（70157）和脂多糖（L2880）購(gòu)自Sigma；胎牛血清（11012-8611）購(gòu)自四季青生物；DMEM高糖培養(yǎng)基（MA0212）和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（MA0082）購(gòu)自美侖生物；BSA封閉液（E661003）購(gòu)自生工生物；β-actin（#3700）、NFκB（#8242）、核因子IκB抑制蛋白α（IκBα）（#9242）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）（#9131）、Anti-Rabbit-HRP（#7074）及Anti-Mouse-HRP（#7076）抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；IL-6 DuoSet ELISA（DY406）和IL-17 DuoSet ELISA（DY421）購(gòu) 自R&D System； Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（ECL）（WBKLS0100）購(gòu)于MILLIPORE公司。

1.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

C57BL/6品系野生型和IRF3基因敲除小鼠，腹腔注射3%巰基乙酸肉湯2.5 mL，3 d后將小鼠頸椎脫臼處死，用75%乙醇浸泡3 min。腹腔內(nèi)注入5 mL預(yù)冷的1×PBS灌洗腹腔，重復(fù)3次。收集的灌洗液在1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌2次，得到野生型和IRF3基因敲除組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，2組細(xì)胞分別分成4組，接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，吸去上清液，去除未貼壁細(xì)胞，PBS洗滌3次后加入2 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)過夜培養(yǎng)備用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IL-17、IL-6的表達(dá)

用100 ng/mL的LPS預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞6、12、24 h后收取上清液，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-17、IL-6。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行：將100 μL捕獲抗體置于96孔板中室溫孵育過夜，次日每孔加入300 μL洗滌液進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。加入300 μL封閉液封閉1 h，洗滌。加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品孵育2 h，洗滌。加入100 μL檢測(cè)抗體孵育2 h，洗滌。加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素避光孵育20 min后，洗滌。加入100 μL的底物避光孵育20 min后，加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀讀取吸光度進(jìn)行分析。

1.4 免疫印跡檢測(cè)IκBα、IRF3、p-STAT3的蛋白水平

LPS預(yù)處理各組細(xì)胞，用預(yù)冷的1× PBS清洗，徹底吸除液體后，每孔加入100 μL的RIPA細(xì)胞裂解液（含有磷酸酶抑制劑和PMSF），冰上裂解30 min。收集裂解液在12 000 r/min離心30 min后收集上清液。用BCA蛋白濃度測(cè)定盒（MA0082，美侖生物）測(cè)得蛋白濃度后定量，加入等量的5×樣品緩沖液，100℃加熱5 min。待蛋白冰上冷卻后，每孔加40 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE膠、80 V電泳。在電壓100 V進(jìn)行75℃轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。BSA封閉液室溫孵育膜1 h，目標(biāo)條帶分別加入一抗IκBα、IRF3、p-STAT3、β-actin，4℃搖床過夜。次日1×（TBS＋吐溫20）洗5 min，共3次。加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h后，洗3次，加入ECL顯色液于暗室中曝光。

2 結(jié)果

2.1 IRF3促進(jìn)LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-17和IL-6的產(chǎn)生

IRF3顯著地促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞IL-17的產(chǎn)生（24 h），而IRF3基因缺失的巨噬細(xì)胞幾乎未產(chǎn)生IL-17（圖1A）。LPS刺激巨噬細(xì)胞6 h后即可觀察到IRF3明顯促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生，IRF3基因缺失的巨噬細(xì)胞未產(chǎn)生IL-6（圖1B）。提示用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞后，IRF3可促進(jìn)IL-17和IL-6的產(chǎn)生，且IL-6的產(chǎn)生早于IL-17。

圖1 IRF3在LPS刺激后促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞IL-17（A）及IL-6（B）的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)

2.2 IRF3促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞STAT3的磷酸化

免疫印跡結(jié)果顯示，在IRF3基因缺失小鼠巨噬細(xì)胞中未觀察到IκBα的降解，但在野生小鼠巨噬細(xì)胞中IκBα明顯被降解（圖2）。在LPS刺激時(shí)IRF3促進(jìn)STAT3的磷酸化，且在IRF3基因缺失小鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量與野生型相比明顯降低（圖2）。

圖2 IRF3在LPS（100 ng/mL）刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后促進(jìn)STAT3的磷酸化，免疫印跡

3 討論

LPS是革蘭陰性菌的內(nèi)毒素，可激活MyD88依賴性的NF-κB和MyD88非依賴性的IRF3轉(zhuǎn)錄因子，引起眾多細(xì)胞因子產(chǎn)生[11]。LPS刺激還可以引起IL-17的產(chǎn)生。在LPS誘導(dǎo)的鼻炎模型中，IL-17的產(chǎn)生呈現(xiàn)出LPS刺激劑量依賴性特征[4]。IRF3對(duì)IL-17表達(dá)的影響存在爭(zhēng)議。有研究表明IRF3參與調(diào)節(jié)IL-17產(chǎn)生[7-8，11]；在肝缺血再灌注模型中IRF3抑制IL-17產(chǎn)生[8]；用poly（I：C）刺激CD8 T淋巴細(xì)胞時(shí)IRF3與RORγt相互作用，抑制IL-17表達(dá)[7]。但另一方面，IRF3可以促進(jìn)IL-17產(chǎn)生，從而影響抗原提呈細(xì)胞的功能[11]。本研究結(jié)果表明IRF3促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生。

IL-6是NF-κB的重要產(chǎn)物，IRF3可促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生[11-14]。IL-6是小鼠促進(jìn)IL-17產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子[15]。小鼠的Th17細(xì)胞分化依賴于TGF-β和IL-6，這些細(xì)胞因子促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及STAT3的活化，從而促進(jìn)IL-17產(chǎn)生[16]。本研究結(jié)果顯示，IRF3促進(jìn)IL-6產(chǎn)生，但在IRF3基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞中幾乎沒有IL-6。IκBα是NFκB的抑制蛋白，磷酸化而被降解后激活NFκB的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)靶基因產(chǎn)生[17-18]。在LPS刺激時(shí)IRF3促進(jìn)IκBα降解，但未檢測(cè)到NF-κB（Ser536）磷酸化，而在IRF3基因敲除巨噬細(xì)胞中幾乎沒有IκBα蛋白降解。

IL-6可以通過激活STAT3而促進(jìn)小鼠IL-17的產(chǎn)生[15，19]，STAT3是IL-17的轉(zhuǎn)錄因子[15，20]。本研究結(jié)果顯示，IRF3促進(jìn)STAT3的磷酸化，在IRF3缺失時(shí)明顯被抑制。由此推測(cè)，IRF3在LPS刺激時(shí)促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生，可能是通過促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生，從而激活I(lǐng)L-17的轉(zhuǎn)錄因子STAT3。IRF3促進(jìn)IL-17產(chǎn)生的這一過程中可能伴隨IL-6的產(chǎn)生和STAT3的磷酸化。這一研究將為深入研究巨噬細(xì)胞IRF3在LPS刺激時(shí)促進(jìn)IL-17的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。