孫婷婷 董樹燕 李魯萍 趙傳華 李天鵬

（棗莊學院，1 食品科學與制藥工程學院；2 棗莊市神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)藥物研發(fā)重點實驗室；3 城市與建筑工程學院，棗莊 277160）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一漸進性神經(jīng)退行性疾病，其典型特征表現(xiàn)為記憶力和認知能力的減退以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)一系列病理改變，其形成機制不明，并且無特效治療藥物[1-3]。研究表明，AD患者腦較之正常人腦有明顯的萎縮[4-5]，并且AD患者海馬神經(jīng)發(fā)生的改變在其典型病理和大量神經(jīng)元丟失之前就已經(jīng)出現(xiàn)[6-7]，推測海馬神經(jīng)發(fā)生在AD的病理形成和進展中具有重要的作用。通過豐富環(huán)境（給實驗動物提供豐富的學習環(huán)境）、機械或藥物損傷海馬等方法使海馬神經(jīng)發(fā)生產(chǎn)生變化，可用于進行新生神經(jīng)細胞的功能研究。然而，這些研究往往得出相悖的結(jié)論，可能與這些研究所用的手術(shù)模型不同有關(guān)[8-11]。至今，對于AD神經(jīng)發(fā)生的變化與學習記憶的關(guān)系一直存在爭論[12-15]。microRNA是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與發(fā)育過程的時序調(diào)節(jié)、細胞周期及分化等過程。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c過表達可明顯增強C57BL/6J小鼠室下區(qū)的神經(jīng)發(fā)生[16]。本研究以APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，通過microRNA過表達和敲減慢病毒載體干擾海馬齒狀回處miR-30c的表達來檢測神經(jīng)發(fā)生與學習記憶的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

18～24 g的8周齡SPF級APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠由南京模式動物中心提供；兔單克隆抗體Ki67購自美國Thermo Fisher公司；鼠單克隆抗體GFAP購自美國Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor?488標記的驢抗兔抗體和Alexa Fluor?594標記的驢抗鼠抗體購自美國Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScript?RT reagent Kit、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自日本TaKaRa公司；實驗中所用引物由上海生工生物工程公司合成；Morris水迷宮及圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)購自上海軟隆科技有限公司；冷凍高速離心機、PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；超純水儀購自美國Millipore公司；正置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；激光共聚焦購自日本Nikon公司；腦立體定位儀購自瑞沃德生命科技有限公司；凝膠成像儀購自北京君意東方電泳科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物分組

初始實驗小鼠分為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生小鼠2組，分別從2組中隨機選取12只以檢測2組小鼠在海馬神經(jīng)發(fā)生和學習記憶上的差異。后續(xù)從APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中隨機選取36只分為3組：APP/PS1假手術(shù)組（AD組，腦立體注射1 μL生理鹽水）、miR-30c過表達組（OE組， 腦立體注射1 μL miR-30c過表達慢病毒）和miR-30c敲減組（KD組，腦立體注射1 μL miR-30c敲減慢病毒），以檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-30c的表達變化對海馬神經(jīng)發(fā)生和學習記憶的影響。

1.3 APP/PS1陽性轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定

對APP/PS1小鼠繁殖的后代進行基因型鑒定，剪取小鼠足趾約2 mm，加入50 mmol/L NaOH 100 μL 100℃下裂解1 h，之后加入Tris-HCl(pH=8.0) 10 μL，12000 r/min離 心20 min，取 上清進行PCR。反應體系為15 μL，其中DNA模板3 μL，2×Taq master mix 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，特異性引物序列：PP-15975'-GACTGACC ACTCGACCAGGTTCTG-3'；PP-15985'-CTTGTAA GTTGGATTCTCATATCCG-3'；PP-1644 5'-AATA GAGAACGGCAG GAGCA-3'；PP-1645 5'-AA TAGAGAACGGCAGGAGCA-3'，ddH2O 3.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，63℃退火35 s和72℃ 延伸45 s，進行30個循環(huán)，然后72℃延伸3 min。產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)記錄鑒定結(jié)果。

1.4 Real-time PCR

利用TRIzol對APP/PS1假手術(shù)組、miR-30c過表達組和miR-30c敲減組3組樣本的海馬組織進行裂解。RNA濃度和純度達到標準后（濃度大于200 ng/μL，A260/A280介 于1.9～2.0），利 用cDNA試劑盒和合成的特異性的頸環(huán)引物進行反轉(zhuǎn)錄（表1），反應體系總體積5 μL，總RNA 模板250 ng，反應體系配制參照試劑盒說明，于42℃反應1 h，并于70℃加熱15 min以使反轉(zhuǎn)錄酶失活。隨后利用SYBR?Premix Ex TaqTM實時定量PCR試劑盒進行擴增，反應條件SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Primer mix （10 μmol/L）4 μL（引物序列見表1），cDNA 50 ng，ddH2O補足至20 μL。擴增反應程序為：95℃預變性2 min，95℃ 5 s，57℃ 30 s，40個循環(huán)，解離程序為：65℃ 5 s，95℃ 5 s。Snord2作為內(nèi)參，每個樣品重復3次，實驗結(jié)果采用2-△△CT方法進行分析。

1.5 腦立體定位

每組取12只5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，行腹腔注射進行麻醉（5%戊巴比妥鈉，70 mg/kg），腦立體定位儀上固定小鼠，暴露腦顱骨，剔除腦膜。以前囟作為坐標零點進行校正。病毒注射坐標為：bregma -1.75 mm，lateral -0.75 mm，ventral+2.3 mm，注射速度為0.2 μL/min，注射完畢后針頭留置20 min再緩慢退出進樣針。切口縫合后，給予保溫措施直至小鼠能夠自主活動，其中miR-30c過表達組注射含miR-30c-OE病毒，miR-30c敲減組注射miR-30c-KD病毒，病毒滴度均在5×108TU/mL～1×109TU/mL（病毒注射量為1 μL），APP/PS1假手術(shù)組注射1 μL生理鹽水。手術(shù)結(jié)束4周后進行免疫熒光和學習記憶行為學檢測。

1.6 水迷宮檢測

對6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生小鼠以及APP/PS1假手術(shù)組、miR-30c過表達組和miR-30c敲減組小鼠的空間學習記憶能力進行檢測。首先讓小鼠熟悉學習記憶環(huán)境，進行適應性游泳。之后進行為期5 d的學習記憶訓練，每天訓練4個象限，記錄小鼠尋找固定平臺所需時間。記錄小鼠90 s內(nèi)尋找到平臺對應的時間，超過90 s記為90 s。第6 天將平臺去除，記錄小鼠穿過平臺的次數(shù)。

1.7 腦片制備

利用5%戊巴比妥鈉溶液行腹腔注射對小鼠進行深度麻醉（75 mg/kg），剪開胸腔，通過左心室穿刺，剪開右心耳，依次用0.01 mol/L PBS和4%多聚甲醛經(jīng)心灌注和在體固定。分離腦，4%多聚甲醛于4℃固定過夜，之后進行梯度蔗糖脫水、OCT包埋和進行厚度為20 μm的連續(xù)矢狀冰凍切片。

1.8 免疫熒光染色

本實驗所用一抗為兔單克隆抗體Ki67（1∶400），鼠單克隆抗體GFAP（1∶500）。切片預處理后用含有0.2% Triton X-100和5%驢血清的封閉液室溫封閉45 min，加入一抗4℃孵育過夜。實驗所用二抗分別是AlexaFluor?488驢抗兔（1∶500）和AlexaFluor?594驢抗鼠（1∶500），二抗室溫孵育2 h。PBS清洗后，滴加抗淬滅熒光封片劑進行封片。

1.9 統(tǒng)計學處理

免疫熒光染色中Ki67陽性細胞用軟件Image-Pro Plus 6.0進行采集，以各組除以對照組Ki67陽性細胞的平均值，得出Ki67陽性細胞的相對倍數(shù)。數(shù)據(jù)用±s表示，使用SPSS 2020進行統(tǒng)計學分析，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩野生小鼠之間的統(tǒng)計學分析采用獨立樣本t檢驗，APP/PS1假手術(shù)組、miR-30c過表達組及miR-30c敲減組小鼠之間的統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)發(fā)生與同窩野生小鼠相比明顯下降

APP和PS1的特異性引物對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定結(jié)果顯示，陽性小鼠在350 bp和608 bp處呈現(xiàn)特異性擴增條帶（圖1A）。隨后，利用Ki67抗體對6月齡和同窩野生小鼠的增殖細胞進行檢測，其中Ki67蛋白參與染色體的組裝過程，在有絲分裂中具有維持染色體的分散狀態(tài)的功能，所以Ki67可作為一種增殖的標志物用于神經(jīng)細胞增殖的檢測。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的Ki67陽性增殖性神經(jīng)細胞數(shù)量明顯少于同窩野生小鼠，約是同窩野生小鼠的0.25倍（P＜0.001）（圖1B～C）。

圖1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生檢測。A：2對引物（引物1597/1598，目標擴增條帶為305 bp；引物1644/1645，目標擴增條帶為608 bp）對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進行鑒定，其中虛線框為第1窩小鼠樣本；實線框為第2窩小鼠樣本；剩下樣本為第3窩小鼠樣本；M：DNA ladder。B：6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩小鼠海馬新生神經(jīng)元免疫熒光檢測，標尺=100 μm，WT：野生小鼠；AD， APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；C：6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生小鼠海馬Ki67陽性細胞相對倍數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果，**P＜0.001 vs WT.

2.2 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩野生小鼠相比學習記憶能力明顯下降

水迷宮實驗結(jié)果顯示，與同窩野生小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因組小鼠要用更多的時間才能找到平臺[APP/PS1轉(zhuǎn)基因組：（60.6±6.54） s；WT組：（43.1±4.15） s，P＜0.05]，并且第6天 的APP/PS1轉(zhuǎn)基因組小鼠穿過駐臺次數(shù)也明顯比同窩野生小鼠少。結(jié)果說明APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力比同窩野生小鼠明顯降低（P＜0.001）（圖2）。

圖2 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩小鼠學習記憶的差異。A：第6天水迷宮檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩小鼠找到駐臺的時間；B：第6天水迷宮檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩小鼠穿過駐臺區(qū)域的次數(shù)（WT：野生小鼠；AD，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠）。*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT.

2.3 miR-30c過表達和敲減載體干預海馬的神經(jīng)發(fā)生

為了驗證海馬齒狀回處神經(jīng)發(fā)生與學習記憶能力之間的關(guān)系，利用之前構(gòu)建并包裝好的miR-30c過表達和miR-30c敲減慢病毒來干預海馬齒狀回處的神經(jīng)發(fā)生。本課題組之前的研究已經(jīng)證實miR-30c能夠調(diào)控側(cè)腦室室下區(qū)的神經(jīng)發(fā)生能力，并且miR-30c過表達后側(cè)腦室室下區(qū)的新生神經(jīng)細胞增加，而miR-30c敲減后，側(cè)腦室室下區(qū)的新生神經(jīng)元減少[16]。為了檢測miR-30c過表達和敲減載體對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回處新生神經(jīng)細胞數(shù)量的影響（相應引物見表1），利用腦立體定位技術(shù)，將上述2種慢病毒載體分別注射于6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中。手術(shù)恢復4周后，利用qRT-PCR對海馬齒狀回處miR-30c的表達（相應引物見表1）和免疫熒光對海馬神經(jīng)發(fā)生情況進行檢測，結(jié)果顯示，miR-30c過表達載體和敲減載體能夠順利表達，其中miR-30c過表達組miR-30c的表達量是對照組的（8.34±0.24）倍，miR-30c敲減組miR-30c的表達量是對照組的（0.45±0.02）倍（圖3 A～B），并且miR-30c過表達后海馬齒狀回處的神經(jīng)發(fā)生明顯增加，約是對照組的14.20倍（P＜0.01）。miR-30c敲減后海馬新生神經(jīng)細胞數(shù)量較對照組有所降低（P＜0.05，圖3 C～D）。Encinas等[17]提出隨著年齡的增加海馬神經(jīng)發(fā)生能力幾乎枯竭，故在此基礎(chǔ)上 進一步降低神經(jīng)發(fā)生，其變化不明顯。

表1 miR-30c過表達、敲減序列及qRT-PCR檢測所用引物

圖3 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-30c過表達、敲減后引起的神經(jīng)發(fā)生變化。A：腦立體定位顯微注射miR-30c過表達和miR-30c敲減慢病毒模式示意圖，注射位置為海馬齒狀回，注射坐標為bregma -1.75 mm，lateral -0.75 mm，ventral +2.3 mm；B：腦立體定位4周后，qRT-PCR檢測海馬miR-30c的相對表達量（*P＜0.05，**P＜0.001 vs AD組）； C：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-30c過表達和敲減后新生神經(jīng)細胞的免疫熒光檢測，標尺=100 μm；D：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-30c過表達和敲減后新生神經(jīng)細胞的統(tǒng)計結(jié)果（*P＜0.05，**P＜0.001 vs AD組）.

2.4 miR-30c引起的新生神經(jīng)細胞的增減與學習記憶能力的關(guān)系

綜上表明，miR-30c可以有效的調(diào)控海馬齒狀回處新生神經(jīng)元的數(shù)量。那么，小鼠的學習記憶能力是否會受到影響呢？本研究利用水迷宮對上述APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠、miR-30c過表達的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和miR-30c敲減的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力進行檢測。對3組小鼠進行了為期5 d的訓練和最后一天穿過駐臺次數(shù)進行檢測。第6 天的測試結(jié)果顯示，與其他2組相比，miR-30c敲減組小鼠需要更多的時間才能找到平臺[AD組（60.1±6.91） s；KD組（82.3±3.25） s；OE組（38.02±3.46） s]，并且miR-30c敲減組小鼠的穿駐臺次數(shù)明顯低于其他2組（P＜0.05vsAD組，P＜0.001vsOE組）（圖5），miR-30c過表達組小鼠尋找駐臺的時間降低，并且穿過駐臺的次數(shù)比AD組有所增加（P＜0.05）（圖4）。

圖4 水迷宮檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-30c過表達和敲減后學習記憶的變化

3 討論

以往β淀粉樣蛋白半乳糖等方法建立的動物模型只能表現(xiàn)出AD的部分病理改變，不完全具備AD的病理特征[18-19]，這極大限制了對AD發(fā)病機制的研究。而本實驗所用的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是過表達APP（APP淀粉樣蛋白前體基因）和PS1（早老素基因），是較為經(jīng)典的AD動物模型。此種小鼠在6月齡時就有明顯的AD病理現(xiàn)象即Aβ淀粉樣蛋白沉積，9月齡時就有明顯的神經(jīng)元缺失。結(jié)果顯示6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)發(fā)生明顯下降，表現(xiàn)為增殖性神經(jīng)細胞數(shù)量的明顯減少，同時本研究利用水迷宮實驗檢測了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學習記憶能力，發(fā)現(xiàn)其學習記憶能力也明顯比同窩野生組小鼠差，說明新生細胞參與了海馬的空間記憶過程。之前有研究利用慢病毒追蹤技術(shù)，顯示海馬齒狀回處新生神經(jīng)元與內(nèi)嗅皮層成熟的顆粒細胞間形成突觸連接，并且有研究表明，正常小鼠每天兩側(cè)海馬中約有1 400個新生神經(jīng)元產(chǎn)生，占總海馬新生神經(jīng)元的1.8%，所以海馬顆粒細胞層的神經(jīng)元不斷地處于更替狀態(tài)中[20]，并有可能參與正常的學習記憶過程[21-22]。

為了進一步驗證成年神經(jīng)發(fā)生與學習記憶能力之間的關(guān)系，本研究利用miR-30c過表達和敲減慢病毒載體，對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回處的神經(jīng)發(fā)生進行干預，顯示當利用miR-30c敲減慢病毒載體，可引起APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回處的神經(jīng)發(fā)生減少，表現(xiàn)為增殖性細胞的減少，其對應的空間學習記憶能力則明顯降低；而miR-30c過表達慢病毒載體可以使APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回處的神經(jīng)發(fā)生明顯增加，對應的空間學習記憶能力有所增強。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)發(fā)生比正常組低，且這些新生細胞的減少，會導致學習記憶能力的明顯降低，說明AD小鼠海馬學習記憶功能的維持需要一定量的新生細胞數(shù)量，提示miR-30c的表達與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)發(fā)生直接相關(guān)，miR-30c表達敲減，神經(jīng)發(fā)生降低，并且對應的學習記憶能力明顯降低；miR-30c過表達，神經(jīng)發(fā)生增加。然而，學習記憶能力的增減與神經(jīng)發(fā)生的變化并非是直線性的，后期需要對新生細胞增殖的分化和成熟過程做詳細的追蹤，并對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生與學習記憶變化間的閾值進行鑒定。