陳永紅 楊 樺# 劉永峰 雷 強(qiáng) 蔚洪恩△

（山西醫(yī)科大學(xué)，1 第五臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030012）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，患病率呈逐年上升趨勢(shì)，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明。興奮性突觸的發(fā)育和功能是腦發(fā)育過程中的重要事件，研究表明突觸功能障礙參與了ASD的發(fā)病機(jī)制[1]。微管作為細(xì)胞骨架中最大的一種，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元和大腦發(fā)育的所有過程[2]，微管的穩(wěn)定性對(duì)神經(jīng)元突觸發(fā)育起著重要作用[3-4]。研究表明ASD的發(fā)病與微管的穩(wěn)定性有著密切的聯(lián)系[5]。微管穩(wěn)定劑埃博霉素D（epothilone D，Epo D）具有促進(jìn)微管蛋白聚合和微管裝配的作用，可以減輕STOP基因敲除小鼠的行為缺陷和改善突觸功能異常[6]。據(jù)此，本研究擬探討微管穩(wěn)定劑 Epo D對(duì)體外培養(yǎng)的ASD模型 BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性突觸結(jié)構(gòu)的影響及機(jī)制，以期為ASD的治療提供新的理論基礎(chǔ)和藥物靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

BTBR小鼠（購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于山西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；埃博霉素D（MedChemExpress公司）；DMSO（索萊寶公司）；Neurobasal培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)基、神經(jīng)生長因子B27、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶、胎牛血清及胎馬血清（美國Gibco公司）；多聚-D-賴氨酸氨溴酸鹽（美國Sigma公司）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒（BOSTER公司）；抗MAP2、STOP、α-tubulin、PSD95、GluN2B、mGluR5抗體（CST公司）；抗acetyl-tubulin抗體（美國Sigma公司）；抗VGLUT1抗體（Synaptic Systems公司）；抗GADPH抗體（Bioworld公司）；羊抗兔 IgG、羊抗鼠 IgG（EarthOx公司）；FITC羊抗兔IgG（ABclonal公司）。

1.2 BTBR小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取孕15～16 d孕鼠脫臼處死，無菌條件下快速取出胚胎置于解剖液中，在體視顯微鏡下解剖分離且剝除腦膜和血管，將大腦皮質(zhì)組織置于培養(yǎng)皿中，胰酶消化，吸管反復(fù)輕柔吹打組織團(tuán)塊，用細(xì)胞篩分散成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、鋪板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，取適量細(xì)胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后換液，培養(yǎng)液換成含B27、青霉素-鏈霉素和L-谷氨酰胺的無血清Neurobasal培養(yǎng)基，以后每3天半量換液，培養(yǎng)10～14 d。

1.3 BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元免疫熒光染色及鑒定

觀察神經(jīng)元的生長狀態(tài)，培養(yǎng)至7 d皮質(zhì)神經(jīng)元已成熟，胞體飽滿，可用于鑒定。4%多聚甲醛固定30 min，0.2% Triton X-100 作用20 min，5%BSA封閉20 min，加入 抗MAP2抗體（1∶100）于4 ℃孵育過夜，次日加入FITC標(biāo)記的熒光二抗（1∶100）于37 ℃避光孵育1 h，二抗孵育結(jié)束后，加入DAPI染液避光孵育15 min，抗熒光衰減劑封片，后共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

細(xì)胞純度計(jì)數(shù)：高倍鏡下每張爬片隨機(jī)選取5個(gè)視野，進(jìn)行免疫熒光陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。分別計(jì)數(shù)MAP2 陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，以及經(jīng)DAPI染核的細(xì)胞總數(shù)。每個(gè)視野下細(xì)胞的純度=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100 %。重復(fù)5次。

1.4 微管穩(wěn)定劑Epo D藥物干預(yù)

將培養(yǎng)至相對(duì)成熟（10 d）的皮質(zhì)神經(jīng)元隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和溶劑對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予10 nmol/L Epo D DMSO溶解、溶劑對(duì)照組給予相同體積的0.1% DMSO溶劑，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后移除含藥物的條件培養(yǎng)基，用加熱的無血清培養(yǎng)基清洗3次，后評(píng)估微管形態(tài)，檢測(cè)微管穩(wěn)定標(biāo)志蛋白、微管相關(guān)蛋白、興奮性突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白及興奮性谷氨酸受體蛋白的表達(dá)水平。

1.5 微管穩(wěn)定性的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

對(duì)培養(yǎng)至10 d的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各2組，分別經(jīng)10 nmol/L Epo D和相同體積的溶劑干預(yù)后，吸棄條件培養(yǎng)基，加熱的無血清培養(yǎng)基清洗3次。一組繼續(xù)保持于培養(yǎng)箱37℃，90 min，另一組給予 4℃冷處理90 min，后迅速細(xì)胞固定，進(jìn)行兔抗α-tubulin抗體（1∶100）免疫熒光染色標(biāo)記微管，倒置熒光顯微鏡下觀察微管形態(tài)，考察神經(jīng)元在冷處理干預(yù)下的穩(wěn)定性，并比較微管穩(wěn)定劑Epo D干預(yù)后微管穩(wěn)定性的變化。

1.6 免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組給予10 nmol/L Epo D、對(duì)照組給予相同體積溶劑干預(yù)24 h后，評(píng)估微管穩(wěn)定標(biāo)志蛋白、微管相關(guān)蛋白、興奮性突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白及興奮性谷氨酸受體蛋白的表達(dá)水平。后裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每孔上樣40 μg蛋白質(zhì)行凝膠電泳，電泳完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%奶粉封閉，然后用一抗acetyltubulin（1∶5 000）、α-tubulin（1∶1 000）、MAP2（1∶1 000）、STOP（1∶750）、PSD95（1∶1 000）、VGLUT1（1∶4 000）、GluN2B（1∶1 000）、mGluR5（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）孵育過夜，洗膜4次后二抗（1∶20 000）孵育l h，PVDF膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，均勻滴加顯影劑，顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Image J軟件、Graphpad Prism 8.0對(duì)免疫印跡圖像進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件分析，所有計(jì)量資料結(jié)果均以±s表示。兩組之間的差異性比較采用t檢驗(yàn)，取a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)神經(jīng)元生長形態(tài)變化（圖1），接種培養(yǎng)2 d后大部分神經(jīng)元伸出突起，胞體多呈錐形，細(xì)胞突起之間、突起與胞體之間開始形成少量連接（圖1A）；培養(yǎng)至4 d可見大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞體積變大，突起生長增多，胞體飽滿，細(xì)胞間形成疏散的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1B）；培養(yǎng)至5 d后，神經(jīng)元胞體變大，突起連接形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也更加明顯（圖1C）；培養(yǎng)至7 d神經(jīng)元突起分支明顯延長，胞體更加飽滿，形成緊密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（箭頭所示），大腦皮質(zhì)神經(jīng)元成熟，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1D）。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察，原代培養(yǎng)的BTBR胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元2～7 d的形態(tài)學(xué)變化。紅色標(biāo)尺=100 μm，白色標(biāo)尺= 50 μm.

2.2 皮質(zhì)神經(jīng)元免疫熒光染色及鑒定

選取培養(yǎng)7 d的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色鑒定（圖2），通過對(duì)神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白MAP2進(jìn)行免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡拍攝觀察染色結(jié)果。觀察可見，細(xì)胞經(jīng)MAP2特異性染色和DAPI非特異性染色后，細(xì)胞在顯微鏡下細(xì)胞體和突起呈現(xiàn)綠色熒光、細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，藍(lán)色熒光的細(xì)胞核大部分位于綠色熒光的細(xì)胞體中央。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示神經(jīng)元純度可達(dá)到70%以上，且生長狀態(tài)良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 免疫熒光鑒定原代培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元純度：MAP2（神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白）、DAPI非特異性標(biāo)記細(xì)胞核。圖片中雜細(xì)胞細(xì)胞核較少，神經(jīng)元純度＞70%。標(biāo)尺=100 μm.

2.3 微管穩(wěn)定性的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

結(jié)果顯示（圖3），在正常的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中，α-tubulin染色均勻地分布在神經(jīng)元胞體、突起中，當(dāng)經(jīng)過低溫刺激后，顯示在Epo D組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中微管能抵抗低溫刺激，α-tubulin染色未見明顯變化。相反，在溶劑對(duì)照組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中，α-tubulin的均一性染色消失，神經(jīng)元突起中的微管結(jié)構(gòu)似乎斷裂成許多顆粒狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)廣泛的微管解體。

圖3 BTBR胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元微管的形態(tài)變化，一組保持在37 ℃，另一組暴露在低溫（4 ℃，90 min）中。微管用α-tubulin（綠色）標(biāo)記。標(biāo)尺=50 μm.

2.4 免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4.1 微管穩(wěn)定的標(biāo)志蛋白和微管相關(guān)蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示（圖4），與溶劑對(duì)照組相比，Epo D實(shí)驗(yàn)組acetyl-tubulin、α-tubulin和STOP蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。MAP2蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 免疫印跡檢測(cè)Epo D干預(yù)后BTBR小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元acetyl-tubulin、α-tubulin、STOP和MAP2蛋白的表達(dá)

2.4.2 興奮性突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示（圖5），與溶劑對(duì)照組相比，Epo D實(shí)驗(yàn)組PSD95蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；VGLUT1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4.3 興奮性谷氨酸受體的表達(dá) 結(jié)果顯示（圖6），與溶劑對(duì)照組相比，Epo D實(shí)驗(yàn)組GluN2B蛋白和mGluR5蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 免疫印跡檢測(cè)Epo D干預(yù)后BTBR小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白PSD95和VGLUT1蛋白的表達(dá)

圖6 免疫印跡檢測(cè)Epo D干預(yù)后BTBR小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性谷氨酸受體GluN2B和mGluR5蛋白的表達(dá)

3 討論

ASD是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，是自幼兒階段即表現(xiàn)出的基于2大領(lǐng)域的損害：持續(xù)的社會(huì)交流和社會(huì)交往障礙；限制性的興趣和重復(fù)行為，通常伴隨著感覺異常和語言發(fā)展的延遲或缺失[7]。ASD患者社會(huì)適應(yīng)差，生活不能自理，需要終身照顧，給社會(huì)和家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。雖然遺傳和環(huán)境因素及其相互作用被普遍認(rèn)為與ASD的發(fā)病有關(guān)，但其確切的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚，仍缺乏有效的治療方法和預(yù)防措施[8]。目前對(duì)ASD的研究大多基于整體動(dòng)物模型。本研究以體外培養(yǎng)的ASD模型BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對(duì)象，通過給予微管穩(wěn)定劑Epo D對(duì)ASD可能的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了初步探索。研究結(jié)果表明Epo D可增加BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元微管的冷穩(wěn)定性及微管穩(wěn)定的標(biāo)志蛋白、微管相關(guān)蛋白的表達(dá)；可以增加BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性突觸結(jié)構(gòu)、興奮性谷氨酸受體相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖7）。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了微管穩(wěn)定性在ASD發(fā)病機(jī)制中的重要作用，為ASD的治療提供了新的可能。

圖7 微管穩(wěn)定劑Epothilone D對(duì)孤獨(dú)癥譜系障礙BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性突觸結(jié)構(gòu)的影響及機(jī)制

穩(wěn)定的微管可以抵抗解聚條件，如寒冷刺激和一些解聚藥物[9]。微管功能障礙是神經(jīng)精神疾病的共同特征，這可能導(dǎo)致了神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[10]。靶向微管藥物的研究正在成為治療各種神經(jīng)精神疾?。ㄈ缗两鹕喜?、阿爾茨海默病和精神分裂癥）的一種策略[11-14]。研究表明，細(xì)胞骨架和微管穩(wěn)定性在ASD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5]。微管相關(guān)蛋白（MAPs）是一類結(jié)合和穩(wěn)定微管的蛋白質(zhì)，MAPs可以穩(wěn)定微管，這被認(rèn)為是神經(jīng)元回路的發(fā)育、維持和功能所必需的[4]。其中MAP6（也稱為STOP蛋白）是一種鈣調(diào)節(jié)蛋白，負(fù)責(zé)神經(jīng)元微管的高度穩(wěn)定以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和突觸可塑性的建立，被認(rèn)為與神經(jīng)元微管對(duì)寒冷刺激和藥物的穩(wěn)定性相關(guān)[15]。研究表明與對(duì)照組相比，ASD患者血漿和BTBR小鼠大腦皮質(zhì)中的STOP顯著減少[1，15]。這些結(jié)果提示STOP基因與ASD發(fā)病有關(guān)。

Epo D是一種天然存在于纖維素黏桿菌中的化合物，可以促進(jìn)微管形成和穩(wěn)定，抑制微管解聚，并且很容易透過血腦屏障，這使其廣泛應(yīng)用于神經(jīng)精神疾病的治療[10]。Epo D具有廣泛的效果，這取決于其所針對(duì)的疾病、涉及的細(xì)胞類型以及藥物在實(shí)驗(yàn)中所采用的劑量和作用時(shí)間[16]。高濃度時(shí)，微管穩(wěn)定劑高度穩(wěn)定微管并干擾其正常破壞，是靶向和治療各種類型惡性腫瘤的手段之一。然而，在低濃度時(shí)這些藥物可以穩(wěn)定足夠的微管，以防止它們?nèi)O化和溶解，甚至促進(jìn)它們的極化，這對(duì)于腦損傷的治療非常重要[17]。10 d的原代皮質(zhì)神經(jīng)元被認(rèn)為是相對(duì)成熟的，突觸蛋白、谷氨酸受體、軸突/樹突連接的增加和電生理特性的改變?cè)谶@一時(shí)間段發(fā)生[16]。因此，本研究選擇10 d的BTBR小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元作為研究對(duì)象。Acetyl-tubulin是一種廣泛應(yīng)用的穩(wěn)定聚合微管的標(biāo)記物，在穩(wěn)定的微管中，α-tubulin在賴氨酸-40位點(diǎn)發(fā)生乙?；?，反之，α-tubulin在非聚合微管中迅速去乙?；痆17]。本研究結(jié)果表明，Epo D可提高BTBR小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元微管的冷穩(wěn)定性，可增加微管穩(wěn)定的標(biāo)志蛋白和微管相關(guān)蛋白的表達(dá)。

興奮性突觸的發(fā)育和功能在ASD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1]。VGLUT1作為興奮性突觸前膜標(biāo)志物，對(duì)于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和正常突觸功能必不可少[18-19]。PSD-95是興奮性神經(jīng)元中突觸后致密物中重要的支架蛋白，調(diào)節(jié)谷氨酸的運(yùn)輸和定位，參與突觸的發(fā)育和可塑性[20]。谷氨酸是最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，通過與谷氨酸受體結(jié)合而引起興奮性突觸傳遞[21]。研究表明，興奮性和抑制性突觸之間的失衡導(dǎo)致大腦功能障礙，并參與ASD的病理過程[21-22]。BTBR小鼠大腦皮質(zhì)的谷氨酸釋放水平低于B6小鼠，而STOP基因敲除小鼠的突觸囊泡密度較低，釋放到突觸間隙中的谷氨酸也較少[21，23]。本研究結(jié)果表明，10 nmol/L Epo D可使BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中興奮性突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、谷氨酸受體蛋白的表達(dá)水平增加。

綜上所述，微管穩(wěn)定劑Epo D能改善體外培養(yǎng)的ASD模型BTBR小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的興奮性突觸結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能與增加微管的穩(wěn)定性有關(guān)，有望成為治療ASD的有效藥物。