劉經(jīng)健，冉鳳英，楊光義，武 倫，楊 洋，朱 婧，陳 琳，梅全喜，李婷婷，陳琴華*

0 引言

宮頸癌是原發(fā)于子宮頸的惡性腫瘤，在全世界惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中居第4位[1]。隨著社會的發(fā)展，我國的宮頸癌患者發(fā)病呈現(xiàn)年輕化，并且發(fā)病率呈上升趨勢[2]。臨床對于宮頸癌的治療以手術(shù)和放療為主，輔以化療、中醫(yī)治療等綜合治療[3]。傳統(tǒng)中藥在提高宮頸癌患者生活質(zhì)量，延長其生存期中具有獨特的優(yōu)勢[4]，發(fā)掘具有抑癌活性的中藥成分顯得尤為重要。

廣藿香是唇形科刺蕊草屬植物，別名刺蕊草、霍香，為“十大南藥”之一。廣藿香酮具有抗菌、抗病毒和抗炎等多種生物活性作用[5-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香酮對前列腺癌、膽囊癌、結(jié)腸癌具有抑制作用[8-10]，但其對宮頸癌的研究未見報道。故本研究選用宮頸癌SiHa細胞，通過不同濃度廣藿香酮干預后，檢測細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲情況，探討廣藿香酮在體外的抗宮頸癌作用，以期為廣藿香酮臨床治療宮頸癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 廣藿香酮購自上海陶素生化科技有限公司，純度≥98%。DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自北京賽澳美細胞技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自上海陶素生化科技有限公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，RIPA裂解液(強)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)均購自江蘇碧云天公司，SDS-PAGE試劑盒購自上海BBI生命科學有限公司，ECL試劑購自美國Millipore公司，兔抗人Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9購自美國Immunoway公司，β-actin單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；MQX-200型全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司)；Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)；IX71型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；UVP INC型凝膠成像系統(tǒng)(中國Gene公司)。

1.3 細胞株 人宮頸癌SiHa細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物的配制與保存 將廣藿香酮溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)中配制成120 mg/ml母液，再依次用DMSO配制成所需濃度，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆?，使用前用培養(yǎng)液稀釋1 000倍至所需給藥濃度，DMSO終濃度≤0.1%。

2.2 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌SiHa細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10%胎牛血清培養(yǎng)液、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當細胞生長密度為80%～90%時，按1∶3傳代培養(yǎng)。

2.3 CCK-8檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的SiHa細胞消化離心，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl體積(2×103/孔)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加藥處理。實驗組分為6個組，分別加入100 μl含有濃度為20、40、60、80、100和120 μg/ml廣藿香酮的完全培養(yǎng)液，對照組加入100 μl含有0.1% DMSO的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復孔。在培養(yǎng)24、48 h時，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后振蕩混勻，酶標儀測定在450 nm波長處各孔的OD值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將處于對數(shù)生長期的SiHa細胞消化離心，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml體積(1×105/孔)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加藥處理。實驗組分為3個組，分別加入2 ml含有40、80和120 μg/ml廣藿香酮的完全培養(yǎng)液，對照組加入2 ml含有0.1%DMSO的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復孔。培養(yǎng)48 h時，應用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒處理各組細胞。消化收集細胞，預冷的PBS清洗細胞2次，500 μl體積的1×Binding Buffer重懸細胞，每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移 SiHa細胞接種于6孔板上，每孔2 ml體積(3×105/孔)，24 h后用200 μl滅菌一次性吸頭做直線劃痕，用PBS洗滌細胞3次后，加入含1%胎牛血清和廣藿香酮(0、40、80、120 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)液，于細胞劃痕后的0、48 h觀察并照相記錄。通過Image J軟件進行愈合率的計算，劃痕愈合率=(初始劃痕面積-現(xiàn)存劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 將基質(zhì)膠加入Transwell小室中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待基質(zhì)膠凝固后吸去殘液。SiHa細胞胰酶消化后用含0.1% 胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度至2×105/ml。Transwell小室放入24孔板中，上室加入200 μl的細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，小室于甲醛后0.1%結(jié)晶紫染液染色，PBS清洗后，棉簽輕輕擦凈小室上層未遷移過去的細胞，在顯微鏡下拍照記錄穿膜細胞數(shù)量。

2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達 SiHa細胞接種于6孔板上，每孔2 ml體積(1×105/孔)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加藥處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h時，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液(強)提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)進行蛋白質(zhì)定量，取蛋白質(zhì)20 μg/孔，10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至 PVDF膜；TBST洗滌后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗人Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9(1∶1 000)和β-actin單克隆抗體(1∶2 000)，室溫反應1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；等體積ECL發(fā)光劑A、B液混勻，并孵育于暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄圖像。

3 結(jié)果

3.1 廣藿香酮對SiHa細胞增殖的影響 CCK-8顯示廣藿香酮對SiHa細胞的增殖有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05，P<0.01)，不同濃度廣藿香酮(0、20、40、60、80、100和120 μg/ml)作用于SiHa細胞24 h、48 h時細胞的存活率如圖1所示。

圖1 廣藿香酮對SiHa細胞增殖的影響(n=5)

3.2 廣藿香酮對SiHa細胞凋亡率的影響 如圖2所示，不同濃度廣藿香酮(0、40、80、120 μg/ml)作用SiHa細胞48 h時，SiHa細胞凋亡率隨藥物濃度的增加而增高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明廣藿香酮能促進SiHa細胞的凋亡。

圖2 廣藿香酮對HepG2細胞凋亡率的影響(n=3)

3.3 劃痕實驗檢測細胞遷移 如圖3所示，不同濃度廣藿香酮(0、40、80、120 μg/ml)作用SiHa細胞48 h時，劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)，SiHa細胞遷移能力隨藥物濃度的增加而降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明廣藿香酮能抑制SiHa細胞的遷移。

圖3 劃痕實驗檢測細胞遷移(n=3，200×)

3.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲 如圖4所示，不同濃度廣藿香酮(0、40、80、120 μg/ml)作用SiHa細胞48 h時，Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)，隨著廣藿香酮濃度的增加，穿過小室的細胞數(shù)量也隨之減少，表明了廣藿香酮能顯著抑制SiHa細胞體外侵襲能力(P<0.01)。

圖4 Transwell實驗檢測細胞侵襲(n=3,200×)

3.5 廣藿香酮影響SiHa細胞Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白的表達 Western blot檢測不同濃度廣藿香酮(0、40、80、120 μg/ml)作用SiHa細胞48 h時Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的表達情況，如圖5所示，隨著廣藿香酮濃度的增加，Bax蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白水平下調(diào)(P<0.01)。

圖5 廣藿香酮對SiHa細胞Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達的影響(n=3)

4 討論

近年文獻報道,植物中一些成分具有抗腫瘤活性，如吉馬酮能抑制宮頸癌Hela細胞增殖和遷移侵襲，促進其凋亡[11]。廣藿香作為一種應用極其廣泛的中草藥，不僅是藿香正氣水、抗病毒口服液和小兒感冒沖劑等眾多有名中成藥的主要成分，在醫(yī)藥、化妝品、園林、香料等領(lǐng)域也有廣泛的應用。Cao等[10]通過結(jié)直腸癌HCT116細胞在體外研究了廣藿香酮的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)廣藿香酮的抗結(jié)直腸癌活性依賴于上調(diào)LC3-Ⅱ、cleaved caspase-7和caspase-3的表達誘導自噬和凋亡，降低AKT/mTOR的磷酸化。在體內(nèi)，150 mg/kg廣藿香酮能夠抑制免疫缺陷小鼠HCT116腫瘤生長，抑制率為43.3%，并能降低Ki67的表達。

細胞凋亡是導致組織損傷的程序性細胞死亡生理過程。對于大多數(shù)常用的抗癌藥物來說，激活凋亡通路以殺死癌細胞是主要的抗癌機制[12]。研究表明，中藥誘導細胞凋亡是發(fā)揮其抗腫瘤活性的重要途徑。如白藜蘆醇通過線粒體和p53信號通路抑制人宮頸癌細胞增殖并促進凋亡[13]。細胞凋亡主要分為內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑(死亡受體途徑)[14]，其中B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族在線粒體凋亡途徑中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2蛋白家族通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性參與細胞凋亡，主要包括以Bcl-2為成員的抗凋亡蛋白和以Bax為成員的促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比例可以反映細胞凋亡的情況[15]。Bcl-2能夠通過抑制封閉細胞核的運轉(zhuǎn)和細胞內(nèi)鈣離子含量的上升發(fā)揮抗凋亡作用[16]，也可與Bax形成同源二聚體或異源二聚體，分別起抑制或促進凋亡的作用[17]。Bax是受Bcl-2調(diào)節(jié)的促凋亡蛋白，能夠通過誘導線粒體滲透性改變、激活凋亡蛋白、釋放細胞色素發(fā)揮促凋亡作用[18],而激活的Bax也可直接或間接地鈍化抑制凋亡的Bcl-2蛋白[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，廣藿香酮可能通過下調(diào)Bcl-2的表達，并上調(diào)Bax的表達以促進SiHa細胞凋亡。

腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移被認為是惡性腫瘤的最主要生物學特征之一，是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的危險階段，是導致腫瘤患者死亡的重要原因[20]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)是一類能特異性地降解細胞外基質(zhì)的鋅依賴酶家族，通過破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[21]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的2個最重要的成員，也是目前研究較為透徹的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的細胞外基質(zhì)降解酶。MMP-2和MMP-9主要通過降解細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，參與血管生長因子的形成，促進腫瘤血管新生，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[22]。本研究首次探討了廣藿香酮抗腫瘤細胞遷移侵襲的作用，證實了廣藿香酮能顯著抑制SiHa細胞的遷移侵襲，這一作用可能與通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)廣藿香酮在體外能顯著抑制宮頸癌SiHa細胞的增殖，可能通過下調(diào) Bcl-2/Bax蛋白的表達促進SiHa細胞凋亡，通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達抑制SiHa細胞的遷移侵襲,這為廣藿香酮作為臨床治療宮頸癌的藥物提供了一定的理論依據(jù)。但本研究未進行體內(nèi)研究，對具體的作用機制研究也不夠深入，這也將是我們下一步實驗需要探討的方向。