郭金雙 趙玉川 郭宣成 鄭秀娥 楊陽 崔濤 夏文龍

1 山東省食品藥品審評查驗中心 （山東 濟南 250014）

2 中國科學院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所結(jié)構(gòu)化學國家重點實驗室 （福建 福州 350002）

3 山東省環(huán)科院環(huán)境檢測有限公司 （山東 濟南 250013）

4 山東博科診斷科技有限公司 （山東 濟南 250102）

內(nèi)容提要：目的：建立一種血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，ATⅡ）的定量檢測方法，并檢驗該方法的性能。方法：通過以時間分辨熒光納米微球作為熒光標記物，結(jié)合雙抗體夾心法原理和免疫層析技術，實現(xiàn)ATⅡ的定量檢測。結(jié)果：工藝條件優(yōu)化結(jié)果顯示，T線包被濃度為1.0mg/mL、結(jié)合物稀釋比例為6倍、檢測時間為5min時，曲線梯度和線性最好。檢測方法在5～700ng/L范圍內(nèi)線性關系良好，方程為y=10.226x–9.1429，R2=0.9989，批內(nèi)精密度CV≤2.90%，批間精密度CV≤4.90%，最低檢測限為1.36ng/L，準確度檢測相對偏差在±1.40%范圍內(nèi)，檢測方法具有良好的分析特異性，交叉反應因子不會影響檢測結(jié)果。測定血清樣本中的ATⅡ濃度，與已上市化學發(fā)光法檢測試劑盒檢測結(jié)果相關性較好，二者的陽性符合率與陰性符合率分別為96.67%和98.18%，假陽性率和假陰性率分別為2.22%和2.73%，診斷符合率為97.50%。結(jié)論：研究建立的ATⅡ定量檢測方法具有操作簡單、檢測快速、結(jié)果準確的優(yōu)點。

高血壓是最常見的慢性疾病之一，其中未能明確原因的原發(fā)性高血壓可能由遺傳、生理、生活習慣等多種原因?qū)е?。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Renin-Angiotensin-Aldosterone System，RAAS）是調(diào)節(jié)水鹽代謝及血管收縮舒張的重要內(nèi)分泌系統(tǒng)，在高血壓發(fā)病過程中起著重要作用[1,2]。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，ATⅡ）是人體血壓偏低時，RAAS被激活，由血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ，ATⅠ）在酶的催化下水解產(chǎn)生的，其受體廣泛分布于心、腦、血管、腎上腺和肺中，是發(fā)揮升壓作用的主要激素之一[3]。ATⅡ的作用是增強交感系統(tǒng)、全身微動脈、靜脈收縮、促進醛固酮和加壓素的分泌、增加回心血量、增強尿鈉排泄[4]。ATⅡ廣泛參與心血管系統(tǒng)的各個過程，可以通過干擾ATⅡ活性來降低高血壓的發(fā)生率和致死率[5]。

檢測血清中ATⅡ已成為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓分型診斷、治療及研究的重要指標，對心血管、腎病、內(nèi)分泌疾病的診斷和治療有重要意義[6]。目前ATⅡ的檢測方法主要有免疫層析法、化學發(fā)光法、放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法等。酶聯(lián)免疫法與化學發(fā)光法操作復雜，反應時間較長，放射免疫分析法污染性較高，相比之下，基于免疫層析法的檢測方法具有操作簡單、成本低、快速便捷等優(yōu)點[7,8]。時間分辨熒光（Time-Resolved Fluorescence，TRF）技術利用銪等鑭系元素的獨特性質(zhì)，其特異性熒光比背景熒光衰變期長140s以上，通過時間的延緩可以過濾掉背景產(chǎn)生的短熒光[9,10]。在時間分辨熒光免疫分析儀中檢測熒光強度與血清中抗原或抗體的濃度成正比，該方法能夠明顯提高檢測信噪比，與其他傳統(tǒng)的熒光檢測技術相比，具有靈敏度高、準確度高、信號穩(wěn)定、動態(tài)范圍寬的優(yōu)點[11,12]。本研究擬將時間分辨熒光納米微球作為熒光標記物，在其表面修飾ATⅡ抗體，建立一種簡便、快捷、準確、高靈敏度的ATⅡ的檢測試劑卡，為ATⅡ精準定量檢測和高血壓疾病診斷提供了堅實的基礎。

1.資料與方法

1.1 一般資料

研究材料：ATⅡ重組抗原、ATⅡ兔源抗體（ab286174）、ATⅡ兔源抗體EPR3873（購自英國Abcam公司）；鼠抗兔IgG抗體（購自上海通蔚生物有限公司）；時間分辨熒光納米微球（蘇州為度生物技術有限公司）；硝酸纖維素膜（德國Sartorius公司）；PVC板、玻璃纖維、吸水紙（上海金標生物科技有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（上海晶純生化科技股份有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺（EDC）（德國sigma公司）；其余化學試劑（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。臨床樣本來自山東省立醫(yī)院的門診及住院患者，臨床診斷為高血壓。

儀器設備：劃膜噴金儀、可編程切條機、壓殼機；CTS300型數(shù)控裁條機（上海金標生物科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱；BKP1000干式熒光免疫分析儀（山東博科快速檢測技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ATⅡ標準品制備

標準品緩沖液配制：純水1000mL、Tris 4.80g、NaCl 10.20g、NaN30.90g、BSA 30.25g、Proclin300 600μL，室溫攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)溶液pH至6.2。

ATⅡ標準品制備：使用標準品緩沖液將ATⅡ重組抗原稀釋為0g/L、5ng/L、10ng/L、30ng/L、60ng/L、150ng/L、300ng/L、700ng/L系列濃度的標準品。

1.2.2 檢測卡制備

熒光微球與ATⅡ抗體偶聯(lián)結(jié)合墊的制備：取900μL標記緩沖液（50mmol MES，pH=6.0），加入100μL時間分辨熒光微球，10μL的NHS（20mg/mL），快速混勻。加入5μL EDC（20mg/mL）快速混勻，室溫孵育20min。離心去掉上清，沉淀用100μL標記緩沖液重懸。加入0.1mg ATⅡ抗體，室溫孵育2h。加入BSA室溫封閉1h。離心去上清，沉淀用1mL結(jié)合物稀釋液（50mmol/L Tris，10%蔗糖，2.5%海藻糖，0.5%酪蛋白，0.5%PVP10，pH 8.0）重懸，獲得熒光微球ATⅡ抗體偶聯(lián)物備用，將該偶聯(lián)物用劃膜噴金儀均勻的噴到玻璃纖維上，37?C電熱鼓風干燥箱干燥3h，制成熒光微球與抗體偶聯(lián)物結(jié)合墊。

硝酸纖維素膜（NC膜）包被：將NC膜貼在PVC板上，用劃膜噴金儀將兔源ATⅡ-EPR3873抗體（T線）和鼠抗兔IgG抗體（C線）包被到NC膜上，37?C電熱鼓風干燥箱干燥3h。

ATⅡ檢測卡制備：用數(shù)控裁條機將吸水紙及玻璃纖維裁切成30.0cm×2.5cm規(guī)格。將吸水紙、熒光微球與抗體偶聯(lián)物結(jié)合墊、玻璃纖維樣品墊依次粘貼到包被NC膜的PVC底板上。使用可編程切條機切條，設定切條寬度4mm，將切好的試紙條裝到塑料卡殼中，得到ATⅡ檢測卡。

1.2.3 標準曲線的擬合

使用本檢測卡檢測0g/L、5ng/L、10ng/L、30ng/L、60ng/L、150ng/L、300ng/L、700ng/L 8個濃度標準品。使用Logistic P4參數(shù)方程將信號比值和濃度值擬合成標準曲線，并將曲線信息錄入ID卡中。

1.2.4 檢測卡條件優(yōu)化

T線包被濃度優(yōu)化：選取T線ATⅡ-EPR3873抗體包被濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL進行篩選驗證，以此確定合適的T線包被濃度。

結(jié)合物稀釋比例優(yōu)化：對熒光微球ATⅡ抗體結(jié)合物分別進行3、6、9倍稀釋，以此確定合適的稀釋比例。

檢測時間的選?。哼x取ATⅡ濃度為10ng/L、60ng/L、300ng/L的標準品，分別在加入樣本后的2min、5min、8min、10min、12min、15min對檢測卡進行檢測，以此確定合適的檢測時間。

1.2.5 檢測卡性能評估

檢測卡性能評估指標主要包括線性、精密度、準確度、最低檢出限、分析特異性等分析性能指標，并通過臨床比對研究驗證檢測卡的臨床性能。各評估項目的評估方法如下。

線性：用濃度為0g/L、5ng/L、10ng/L、30ng/L、60ng/L、150ng/L、300ng/L、700ng/L的ATⅡ標準品檢測線性關系，每濃度重復檢測3次，計算相關系數(shù)。

精密度：①批內(nèi)精密度：同一批次檢測卡分別對10ng/L、60ng/L、300ng/L三個濃度的標準品各做10次重復實驗，計算其變異系數(shù)CV（%）。②批間精密度：選用3個批次檢測卡分別對10ng/L、60ng/L、300ng/L三個濃度的標準液各做10次重復實驗，計算其變異系數(shù)CV（%）。

準確度：用檢測卡分別對10ng/L、60ng/L、300ng/L三個濃度的標準液進行3次重復檢測，計算測定均值和相對偏差。

最低檢出限：用檢測卡對0g/L標準品進行20個重復檢測，計算檢測結(jié)果均值x和標準差SD，x+2SD即為本檢測卡最低檢出限。

分析特異性：向不含ATⅡ的血清中添加血管緊張素Ⅰ，使其濃度為2000ng/L，用檢測卡檢測ATⅡ的濃度值。

臨床比對實驗：選取臥位和立位各100例臨床血清樣本，血清樣本由新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程股份有限公司的血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ）測定試劑盒（化學發(fā)光法）和本檢測卡平行測定。參考區(qū)間：臥位為25～60ng/L，立位為50～120ng/L。對兩種方法檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算出本方案的陽性符合率、陰性符合率、假陽性率、假陰性率和診斷符合率。

2.結(jié)果

2.1 工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 最適T線包被濃度

T線包被濃度分別為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL和2.0mg/mL。由圖1可知，包被濃度為0.5mg/mL時，當ATⅡ標準品濃度達300ng/L以上，T/C值會出現(xiàn)下降趨勢；包被濃度為1.0mg/mL、1.5mg/mL和2.0mg/mL時，梯度和線性均良好，最終選擇1.0mg/mL。

圖1. ATⅡ包被抗體濃度與T/C值

2.1.2 最適結(jié)合物稀釋比例

最適結(jié)合物稀釋比例篩選結(jié)果見圖2，當結(jié)合物稀釋比例為9倍，ATⅡ標準品濃度達150ng/L以上時，T/C值逐漸趨于平衡；當結(jié)合物稀釋比例為3倍和6倍時，曲線線性良好，最終選擇6倍稀釋比例。

圖2. ATⅡ結(jié)合物稀釋倍數(shù)與T/C值

2.1.3 最佳檢測時間

檢測結(jié)果如圖3所示，在檢測時間達到5min時，10ng/L、60ng/L、300ng/L的標準品T/C值均趨于穩(wěn)定狀態(tài)，故最佳檢測時間選為5min。

圖3. 檢測時間與T/C值

2.2 性能評估

2.2.1 線性

結(jié)果如圖4所示，該方法在5～700ng/L范圍內(nèi)線性關系良好，方程為y=10.226x–9.1429，R2=0.9989。

圖4. ATⅡ檢測卡線性

2.2.2 精密度

批內(nèi)精密性分析結(jié)果如表1所示，三個濃度其變異系數(shù)CV（%）分別為2.43%、1.80%、2.90%；批間精密性分析結(jié)果如表2所示，三個濃度其變異系數(shù)CV（%）分別為4.37%、4.30%、4.90%。

表1. ATⅡ檢測卡批內(nèi)精密度分析

表2. ATⅡ檢測卡批間精密度分析

2.2.3 準確度

準確度分析結(jié)果如表3所示，計算測定均值和相對偏差，三個濃度其相對偏差分別為-1.40%、1.30%、0.60%。

表3. ATⅡ試紙條準確度分析

2.2.4 最低檢出限

用檢測卡對0g/L標準品進行20個重復檢測，其結(jié)果如表4所示，所得最低檢出限為1.36ng/L。

表4. ATⅡ檢測卡最低檢出限分析

2.2.5 分析特異性

用檢測卡檢測濃度為2000ng/L的ATⅠ，結(jié)果分別為10.23ng/L、12.97ng/L、9.84ng/L，均<20ng/L。

2.2.6 比對實驗

將自制檢測卡與商品化檢測方法分別檢測臨床血清樣本進行對比，結(jié)果如表5所示，統(tǒng)計分析結(jié)果如下：陽性符合率96.67%，陰性符合率98.18%，假陽性率2.22%，假陰性率2.73%，診斷符合率97.50%。本方案自制檢測卡和新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程股份有限公司的血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ）測定試劑盒（化學發(fā)光法）檢測效果相近。

表5. 兩種檢測方法結(jié)果分析

3.討論

研究建立了一種AT的定量檢測方法，并檢驗該方法的性能。主要通過以時間分辨熒光納米微球作為熒光標記物，結(jié)合雙抗體夾心法原理和免疫層析技術，實現(xiàn)ATⅡ的定量檢測。工藝條件優(yōu)化結(jié)果顯示，T線包被濃度為1.0mg/mL、結(jié)合物稀釋比例為6倍、檢測時間為5min時，獲得最優(yōu)曲線梯度和線性。檢測方法在5～700ng/L范圍內(nèi)線性關系良好（R2=0.9989）。批內(nèi)精密度CV≤2.90%，批間精密度CV≤4.90%，準確度檢測相對偏差均在±1.40%以內(nèi)，最低檢測限達到1.36ng/L，顯示檢測方法具有優(yōu)良的精密度、準確度和靈敏度。檢測方法具有良好的分析特異性，交叉反應因子不會影響實驗結(jié)果。檢測方法檢測血清樣本與已上市化學發(fā)光法檢測試劑盒比較，檢測結(jié)果相關性較好，二者的陽性符合率與陰性符合率分別為96.67%和98.18%，假陽性率和假陰性率分別為2.22%和2.73%，診斷符合率為97.50%。

綜上，研究建立的基于應用時間分辨熒光免疫層析技術定量檢測ATⅡ的方法檢測速度快、操作簡便、分析性能和臨床性能良好。