黃麗娟，李 芳，舒 超，張秀娟，孔 紅

1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二師庫爾勒醫(yī)院病理科，新疆巴音郭楞 841000；2.河北省保定市第二醫(yī)院病理科，河北保定 071051；3.庫爾勒市第一人民醫(yī)院病理科，新疆巴音郭楞 841000

宮頸鱗狀細胞癌(SCC)是一種較為常見的女性生殖道惡性腫瘤，該腫瘤經(jīng)歷了由上皮內(nèi)病變逐步發(fā)展為癌的一個漸進的病理過程。白細胞分化抗原109(CD109)是一種細胞表面糖蛋白抗原，與糖基化磷脂酰肌醇聯(lián)結(jié)[1]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)家族是一個由STAT基因編碼合成的蛋白質(zhì)家族，其中STAT3為凋亡抑制基因，有研究表明STAT3與多種腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切[2]。長期持續(xù)性的高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是導(dǎo)致SCC和宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)的高危因素，90%以上的宮頸癌患者被檢測出HR-HPV[3]。本研究采用免疫組化法檢測正常宮頸上皮(NCE)、SIL、SCC組織中CD109和STAT3的表達情況，采用雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法檢測NCE、SIL和SCC組織中HR-HPV的感染情況，探討CD109、STAT3及HPV在SCC癌變過程中的表達、與臨床病理特征的關(guān)系及三者間的相互關(guān)系。希望能進一步探討SCC的發(fā)病機制，為SCC患者的診斷和治療提供一定的理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2020年9月新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二師庫爾勒醫(yī)院病理科收集的136例患者手術(shù)切除或?qū)m頸活檢標(biāo)本的存檔石蠟包埋蠟塊為研究對象。因子宮肌瘤或腺肌癥行全子宮切除的27例NCE作為對照，納入NCE組；SIL患者78例納入SIL組，其中低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)23例(29.49%，23/78)、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)55例(70.51%，55/78)分別納入LSIL組、HSIL組；SCC患者31例納入SCC組，SCC組中角化型1例(3.23%，1/31)、非角化型30例(96.77%，30/31)。NCE組年齡25～64歲，平均(47.03±11.29)歲；LSIL組年齡20～66歲，平均(46.57±11.24)歲；HSIL組年齡25～78歲，平均(47.25±12.25)歲；SCC組年齡37～89歲，平均(53.01±13.37)歲。所有的病理切片均經(jīng)過2名高年資病理醫(yī)師復(fù)診。本研究已通過新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二師庫爾勒醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。

1.2方法

1.2.1收集資料 收集所有研究對象年齡、腫瘤最大徑、組織分化程度[4]、臨床分期(FIGO2018臨床分期[5])、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等資料。

1.2.2免疫組化染色 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片后進行常規(guī)HE染色及免疫組化染色。兔抗人CD109多克隆抗體、鼠抗人STAT3單克隆抗體(OTI21E7)均購自O(shè)riGene公司，免疫顯色試劑購自Leica公司。免疫組化染色使用LEICA BOND-MAX全自動免疫組化儀進行。

1.2.3雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法 136例患者均使用專用HPV標(biāo)本采樣刷采集宮頸脫落細胞，檢測HPV感染情況。標(biāo)本及試劑恢復(fù)至室溫后，按照試劑盒說明書進行變性、雜交、捕獲、檢測、化學(xué)發(fā)光讀數(shù)。HPV核酸檢測試劑盒購于杭州德同生物技術(shù)有限公司。捕獲微孔板A和(或)捕獲微孔板B顯示陽性為HPV陽性結(jié)果。

1.2.4免疫組化染色評定標(biāo)準(zhǔn) CD109定位于細胞質(zhì)和細胞膜，其陽性表達主要為細胞質(zhì)和細胞膜有棕黃色顆粒。STAT3定位于細胞質(zhì)，少部分在細胞核，在細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性細胞占腫瘤區(qū)域的百分比進行評分[6]，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性腫瘤細胞數(shù)占總的腫瘤細胞數(shù)<10%為0分、10%～<30%為1分、30%～<60%為2分、≥60%為3分。無著色記為0分、淡黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分。兩項得分相乘結(jié)果為0～4分判為陰性，≥5分判為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman相關(guān)進行相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CD109免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果表明，NCE組中未見CD109陽性表達，SIL組和SCC組中CD109的陽性率分別為35.90%和58.06%，SCC組的CD109陽性率高于SIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。在不同級別的SIL組織中，CD109的陽性率隨SIL病變程度的增加而升高，HSIL組CD109的陽性率明顯高于LSIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。CD109在SCC和宮頸HSIL中的陽性表達見圖1。進一步研究SCC組，發(fā)現(xiàn)CD109的陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中(100.00%)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(48.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他不同臨床病理特征SCC患者CD109的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

注：A為CD109在SCC中的陽性表達(×100)；B為CD109在宮頸HSIL中的陽性表達(×400)。圖1 CD109的陽性表達

2.2STAT3免疫組化染色結(jié)果 NCE組、SIL組和SCC組中STAT3的陽性率分別為29.63%、57.69%和90.32%，SCC組的STAT3的陽性率明顯高于NCE組和SIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。STAT3在SIL組中的陽性率也隨SIL病變程度的增加而升高，HSIL組的STAT3的陽性率明顯高于LSIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。STAT3在SCC和宮頸HSIL中的表達見圖2。SCC組中，STAT3的陽性率在不同臨床病理特征患者間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

注：A為STAT3在SCC中的陽性表達(×100)；B為STAT3在宮頸HSIL中的陽性表達 (×400)。圖2 STAT3的陽性表達

2.3HPV感染率 NCE組、SIL組、SCC組中HPV陽性率分別為18.52%、76.92%和93.55%。SCC組和SIL組HPV陽性率明顯高于NCE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SCC組的陽性率也高于SIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。HSIL組HPV的陽性率高于LSIL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。SCC組中，HPV陽性率在不同臨床病理特征患者間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表1 NCE、SIL、SCC組中CD109、STAT3和HPV的陽性表達情況[n(%)]

表2 LSIL組、HSIL組中CD109、STAT3和HPV的陽性表達情況[n(%)]

表3 CD109、STAT3、HPV在不同臨床病理特征SCC患者中的陽性表達情況分析[n(%)]

2.4CD109與STAT3表達、HPV感染的相關(guān)性分析 136例研究對象中CD109與STAT3呈正相關(guān)(r=0.208，P<0.001)，CD109表達與HPV感染呈正相關(guān)(r=0.291，P<0.001)。

3 討 論

宮頸癌是一種常見的生殖道腫瘤，病死率很高。全球每年大約有50萬人因?qū)m頸癌而就診，大多數(shù)死亡患者和新發(fā)患者在發(fā)展中國家。宮頸癌篩查和HPV疫苗接種有助于減少宮頸癌的發(fā)生[7]。目前普遍認(rèn)為，宮頸癌的高風(fēng)險因素是HPV感染，而持續(xù)性HPV感染很可能引發(fā)宮頸病變[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著患者宮頸病變級別逐漸升高，患者HPV陽性率升高，提示HPV感染與宮頸病變嚴(yán)重程度關(guān)系密切。CD109是一種細胞表面抗原，研究發(fā)現(xiàn)，在健康人睪丸組織及某些腫瘤細胞系(包括鱗狀細胞癌及膠質(zhì)母細胞瘤細胞)中CD109呈高表達[9]。HASHIMOTO等[10]對33例肺癌患者進行分析，發(fā)現(xiàn)約1/2鱗狀細胞癌組織中CD109表達明顯升高，而在腺癌、小細胞肺癌和大細胞肺癌組織中CD109均未見表達。除了肺鱗狀細胞癌，ZHANG等[11]報道，相較于子宮內(nèi)膜樣腺癌、正常宮頸鱗狀上皮及正常子宮內(nèi)膜腺上皮，SCC組織中CD109的表達升高。可見在一些腫瘤組織中，尤其是鱗狀細胞癌組織中CD109的表達上調(diào)。STAT是一種細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，可以與細胞核中的DNA結(jié)合，并參與靶基因的調(diào)控，從而介導(dǎo)一系列病理、生理變化(包括腫瘤細胞增殖、腫瘤細胞侵襲、腫瘤細胞浸潤、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和凋亡)[12]。因此，STAT是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控因子。STAT3是表皮生長因子受體(EGFR)、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路匯聚的焦點，在多種腫瘤細胞和組織中都有過度表達[13]。

本研究采用免疫組化及雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法對NCE、SIL、SCC做了初步研究，旨在探討CD109、STAT3、HPV與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，CD109、STAT3、HPV的表達隨著病變級別的升高而逐漸升高，提示3項指標(biāo)可以作為SIL進展成癌的早期標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，在不同年齡、腫瘤最大徑、分化程度、臨床分期SCC患者中，CD109、STAT3、HPV的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而CD109在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SCC患者中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示CD109的高表達更易于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。從LSIL、HSIL到SCC，CD109在子宮頸鱗狀上皮癌變過程中的表達呈逐漸升高的趨勢，并且在SCC組中，CD109的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；CD109與STAT3呈正相關(guān)關(guān)系，在宮頸癌的癌變過程中起協(xié)同作用。該結(jié)果與MO等[14]研究具有一定的相似性，MO等[14]發(fā)現(xiàn)，CD109在SCC組織中的表達明顯高于正常宮頸組織，并且CD109在不同臨床TNM分期/分級SCC組織間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。有研究顯示，TGF-β信號通路的異常與SCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[15]。CD109是TGF-β/Smads信號通路中新的輔助受體，在人類角質(zhì)形成細胞中CD109可負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β。CD109在某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且CD109作為TGF-β受體，可以和TGF-β1綁定形成異構(gòu)體復(fù)合物TGF-β受體Ⅰ和Ⅱ (TGFβRⅠ/TGFβRⅡ)，并加速TGFβR1蛋白酶體的降解[16]。但CD109在SCC中與TGF-β信號通路有無關(guān)聯(lián)，當(dāng)前尚未知。STAT3與多種腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系，白細胞介素、生長因子等能引發(fā)STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3(p-STAT3)進入細胞核顯示出致癌作用，參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及抗凋亡，STAT3過度表達可導(dǎo)致細胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在SCC中，CD109影響STAT3信號轉(zhuǎn)換器和激活因子的激活，可能是由EGFR介導(dǎo)的。具體為CD109的高表達會提高體外和體內(nèi)的致瘤性及侵襲性，同時該因子可能誘導(dǎo)EGFR介導(dǎo)的STAT3磷酸化，進而影響STAT3所介導(dǎo)的細胞遷移、增殖等[15]。同樣本研究也發(fā)現(xiàn)CD109與STAT3存在明顯的正相關(guān)，進一步證實了以上結(jié)果的科學(xué)性。但當(dāng)前相關(guān)的機制分析文獻報道甚少，關(guān)于CD109如何促進宮頸癌腫瘤侵襲性的詳細機制尚不清楚，其具體機制還有待深入分析。

本研究采用免疫組化及雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法對CD109、STAT3、HPV在SCC癌變過程中的作用做了初步研究，可以相信，隨著研究的不斷推進，CD109、STAT3、HPV作為宮頸癌診斷標(biāo)志物的價值將會逐漸清晰。