魏慶玲，梁 睿，李冬秀，陳偉榮，吳學(xué)威，黃 湘，3△

1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510000；2.中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東佛山 528000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(G6PDd)是由于基因缺陷而引起紅細(xì)胞膜表面葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)降低，使得維持紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的還原型谷胱甘肽生成減少而不能抵抗氧化損傷而造成的疾病。新生兒G6PDd主要臨床表現(xiàn)為急性溶血、遺傳性非球形細(xì)胞性溶血性貧血、高膽紅素血癥，因新生兒血腦屏障尚未完全建立，易引起核黃疸導(dǎo)致人體腦部損傷等[1-3]。全自動熒光免疫分析儀(GSP)操作便捷，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性較高[4]，中山市博愛醫(yī)院(以下簡稱本院)2017年引進(jìn)GSP，本文旨在探討GSP篩查系統(tǒng)用于新生兒G6PDd篩查的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2018年3-8月中山市分娩的2 742例新生兒為研究對象，為全市23個(市)鎮(zhèn)區(qū)25家醫(yī)院分娩的新生兒，均送外周血(足跟血或臍血)標(biāo)本至中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心(以下簡稱本中心)進(jìn)行G6PDd篩查，排除早產(chǎn)兒及低出生體質(zhì)量兒。

1.2儀器與試劑 主要儀器有芬蘭 PerkinElmer(PE)公司生產(chǎn)的GSP(型號2021-0010)，芬蘭PE公司生產(chǎn)的半自動熒光免疫分析儀(型號Victor2D1420，半自動熒光免疫分析法)及Panthera-PuncherTM9打孔儀，廣州豐華生物工程有限公司生產(chǎn)的微量振蕩器(型號FWZ-1)等。試劑盒使用芬蘭PE公司生產(chǎn)的GSP Neonatal G6PD試劑盒(全自動熒光免疫分析法)、Neonatal G6PD試劑盒(半自動熒光免疫分析法)。

1.3標(biāo)本采集 嚴(yán)格按照原衛(wèi)生部《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范(2010版)》制作濾紙干血片：在新生兒出生48～72 h充分哺乳后采集足跟血，制成濾紙干血片，干血片室溫平放晾干后，4 ℃保存，最遲不宜超過5 d送至本中心進(jìn)行篩查。

1.4方法 試驗步驟嚴(yán)格按照GSP Neonatal G6PD試劑盒說明書操作，分析GSP的精密度、正確度、線性范圍等，并與廠家聲明的參數(shù)進(jìn)行比較。

1.4.1精密度驗證 采用試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品B、D、E 3個濃度標(biāo)本作為測試標(biāo)本，每個濃度標(biāo)本每天測量1個批次，共進(jìn)行5 d，每批次對各濃度標(biāo)本重復(fù)測量3次，每個濃度各15個測量值，計算批內(nèi)變異系數(shù)(CV批內(nèi))、批間變異系數(shù)(CV批間)和總變異系數(shù)(CV總)。

1.4.2正確度驗證 采用試劑盒自帶質(zhì)控品L(指定靶值16.4 U/dL)和H(指定靶值56.1 U/dL)兩個濃度標(biāo)本作為測試標(biāo)本，每份標(biāo)本每天測量1個批次，每批次測量5次，共進(jìn)行5 d，每個濃度各25個測量值，統(tǒng)計測量總均值與靶值的相對偏差是否小于10%(1/3TEa)。

1.4.3線性范圍驗證 采用試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品B、C、D、E、F作為測量標(biāo)本，濃度梯度分別為9.0、18.3、35.5、77.1、120 U/dL。每個標(biāo)本測量3次，在同一批測量中完成，考察測量均值與理論值的線性關(guān)系。

1.4.4質(zhì)控 每批測試均進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)本測量，當(dāng)質(zhì)控品結(jié)果超出規(guī)定的失控限時剔除，重新進(jìn)行試驗。

1.4.5cut-off值的設(shè)定 嚴(yán)格依據(jù)GSP Neonatal G6PD 試劑盒和Neonatal G6PD試劑盒說明書同步檢測2 742例新生兒濾紙干血片的血G6PD水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。檢測值與理論值的關(guān)系采用線性回歸方程分析。采用Dixon方法檢查并剔除離群值，采用百分位數(shù)分布及受試者工作特征(ROC)曲線建立cut-off值；兩種儀器檢測結(jié)果一致性檢驗采用Kappa檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GSP性能驗證

2.1.1精密度驗證結(jié)果 GSP檢測試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品B、D、E中G6PDCV批內(nèi)分別為2.09%、1.54%、1.90%，均小于廠家聲明的CV批內(nèi)(3.40%)；CV批間分別為2.45%、1.03%、1.26%；CV總分別為3.08%、1.72%、2.12%，小于廠家聲明的最低CV總(3.90%)。

2.1.2正確度驗證結(jié)果 質(zhì)控濃度為L的25份標(biāo)本的測量總均值與靶值的相對偏差為3.84%，質(zhì)控濃度為H的25份標(biāo)本的測量總均值與靶值的相對偏差為3.44%，均小于10%，試劑盒檢測G6PD正確度符合要求。

2.1.3線性范圍驗證結(jié)果 B、C、D、E、F 5個濃度的試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本的檢測值和理論值的線性回歸方程為Y=1.008 2X+0.012 5，決定系數(shù)(R2)為0.999 1，線性相關(guān)性良好見圖1。

圖1 GSP檢測G6PD檢測值和理論值線性關(guān)系

2.2GSP檢測結(jié)果

2.2.1GSP檢測結(jié)果的百分位數(shù)分布 2 742例新生兒的血G6PD水平P1、P5分別為4.27、20.10 U/dL。以P1為cut-off值時，2 742例新生兒中27例篩查陽性(篩查陽性率為0.985%)，其中女2例，男25例；以P5為cut-off值時，2 742例新生兒中135例篩查陽性(篩查陽性率為4.923%)，其中女48例，男87例。

2.2.2ROC曲線分析 G6PD診斷G6PDd的曲線下面積(AUC)為0.963。ROC 曲線以約登指數(shù)(靈敏度+特異度-1)最大值為最佳診斷值，即cut-off值為22.40 U/dL時靈敏度及特異度最高。以22.40 U/dL為cut-off值時，2 742例新生兒中175例篩查陽性(篩查陽性率為6.382%)，其中女74例，男101例。見圖2、表1。

圖2 采用G6PD篩查G6PDd的ROC曲線

表1 不同G6PD水平診斷G6PDd的靈敏度和特異度

續(xù)表1 不同G6PD水平診斷G6PDd的靈敏度和特異度

2.2.3兩種儀器檢測結(jié)果比較 GSP和半自動熒光免疫分析儀對2 742例新生兒濾紙干血片同步進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示半自動熒光免疫分析儀篩查陽性90例，陰性2 652例，GSP篩查陽性135例，陰性2 607例，兩種儀器檢測結(jié)果具有一致性(Kappa=0.783,P<0.001)。以半自動熒光免疫分析儀為標(biāo)準(zhǔn)，GSP的靈敏度、特異度、陽性符合率分別為65.92%、99.96%、98.29%。見表2。

表2 兩種儀器檢測結(jié)果比較(n)

3 討 論

G6PD的檢測方法包括熒光斑點定性試驗、速率法、熒光分析法、G6PD/6PGD比值法等[5-9]。 GSP操作更便捷，能夠減少實驗技術(shù)人員的手工操作時間，特別適合開展大規(guī)模的新生兒疾病篩查。本院按照臨床定量實驗性能驗證方案對GSP檢測G6PD的精密度、正確度和線性范圍進(jìn)行了評估，并初步確定cut-off值[10-11]。

實驗檢測結(jié)果準(zhǔn)確和穩(wěn)定是遺傳代謝病診斷的最基本前提。正確度的驗證結(jié)果表明GSP配套的G6PD檢測試劑盒自帶的高、低兩個濃度的質(zhì)控品和靶值的相對偏差小于10%(1/3TEa)，說明GSP檢測G6PD的正確度通過驗證。從精密度的驗證結(jié)果看，應(yīng)用GSP對試劑盒自帶兩個濃度質(zhì)控品檢測的CV批內(nèi)分別為2.09%、1.54%和1.90%，CV總分別為3.08%、1.72%和2.12%，均小于廠家聲明的3.40%和3.90%，說明GSP新生兒篩查系統(tǒng)檢測G6PD的精密度符合要求；線性范圍的驗證結(jié)果顯示測定項目理論值與測定均值的R2為0.999 1，GSP檢測G6PD的檢測值和理論值具有非常高的線性相關(guān)性，線性范圍內(nèi)符合要求，總之GSP的精密度、正確度、線性范圍與廠商聲明的分析性能基本一致，能夠滿足臨床檢測要求。通過對2018年3-8月2 742例新生兒GSP檢測結(jié)果分析，對比百分位數(shù)分布和ROC曲線分析設(shè)立的cut-off值，ROC曲線篩查的陽性率更高，相應(yīng)的假陽性率也會升高，因此其更適合于標(biāo)本量大的數(shù)據(jù)，故新生兒G6PD cut-off值以G6PD水平P5為標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。2 742例新生兒干血片標(biāo)本在GSP上測得的G6PD水平P5為20.10 U/dL。以P5(20.10 U/dL)為cut-off值，初篩陽性率為4.923%，其中48例女性，87例男性。2008年陳亞軍等[14]報道韶關(guān)市71 892例新生兒G6PDd初篩陽性率為5.19%(3 729/71 892)；2013年郭小玲等[15]報道中山市25 021例新生兒G6PDd篩查陽性率為3.63%(908/25 021)，其中男性陽性率為5.40%，女性陽性率為1.40%；2016年張延瑋等[16]報道汕頭市104 079例新生兒G6PDd初篩陽性率為1.60%；2017年劉冬霞等[17]報道清遠(yuǎn)市57 815例新生兒G6PDd初篩陽性陽性率為6.17%(3 568/ 57 815)；2018年唐芳等[18]報道廣州市16 319例新生兒中，G6PDd篩查陽性率為4.21%(687/16 319)，其中男6.40%，女1.70%；2019年楊應(yīng)松等[19]報道江門市73 813例新生兒總體篩查陽性率為4.14%(3 027/73 183)，男女篩查陽性率分別為 6.88%(2 632/38 240)、1.13%(395/34 943)，總體篩查陽性率接近本研究中采用P5為cut-off值時的篩查陽性率。另外，以半自動熒光免疫分析儀篩查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，cut-off值為21.00 U/dL時，計算得出GSP檢測結(jié)果的特異度、陽性符合率均較高，若以ROC曲線計算出的22.40 U/dL為cut-off值，將召回更多的患兒，提高假陽性率。本研究通過百分位數(shù)分布計算得出的新生兒G6PD篩查cut-off值僅作為項目開展初期實驗室的初始cut-off值。

綜上所述，GSP用于中山市新生兒篩查G6PD檢測性能和廠家聲明的一致，檢測系統(tǒng)具有良好的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍，對比GSP與半自動熒光免疫分析儀一致性較好，說明將GSP篩查系統(tǒng)應(yīng)用于新生兒G6PD的檢測是可行的。通過本研究還確定了GSP檢測新生兒G6PD的cut-off值，明確了參考值對G6PDd的診斷、治療和預(yù)后判斷有重要指導(dǎo)意義。本中心將定期回顧性分析總結(jié)，增大標(biāo)本量后可重新設(shè)定cut-off值，并根據(jù)不同的胎齡和體質(zhì)量進(jìn)一步校正篩查cut-off值，以提高篩查工作質(zhì)量和篩查效率。