牛騰耀，崔振華，高 強(qiáng)，岳曉琪，詹靜慧，張艷麗

寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，寧夏銀川 750004

1型糖尿病(T1DM)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞破壞引起的自身免疫性疾病，嚴(yán)重威脅人體健康。T1DM患者因自身免疫及胰島β細(xì)胞被損傷，引起胰島素分泌不足，必須長(zhǎng)期采用胰島素進(jìn)行治療，而我國(guó)T1DM的發(fā)病率為1.01/10 000[1]。定位于淋巴濾泡的濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞是發(fā)揮免疫效應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群，是一種輔助B細(xì)胞[2]。研究表明，CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞是與淋巴濾泡中的Tfh細(xì)胞功能對(duì)應(yīng)的細(xì)胞群體，可分泌白細(xì)胞介素(IL)-21，并促使B細(xì)胞增殖分化，使體液免疫增強(qiáng)[3-4]。眾所周知IL-6是趨化因子家族成員之一，主要由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等生成，其作用靶細(xì)胞較多，是一種具有復(fù)雜生理功能的細(xì)胞因子，與感染性疾病有關(guān)，可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化。IL-21是Tfh細(xì)胞活化后分泌的特征性細(xì)胞因子，主要存在于生發(fā)中的B細(xì)胞卵泡中，可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活性[5]。但I(xiàn)L-6能否作用于Tfh細(xì)胞參與自身免疫性疾病的發(fā)生尚不清楚，本研究通過分析T1DM患者外周血中CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比與IL-6、IL-21之間的相互關(guān)系，嘗試為T1DM的發(fā)病機(jī)制與診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年10月至2020年10月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“本院”)內(nèi)分泌科住院的30例T1DM患者為研究組。所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的T1DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，以無任何自身免疫性疾病、C肽釋放正常為排除標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期在本院體檢的20例健康者作為健康對(duì)照組，均無感染性疾病、自身免疫性疾病及糖尿病。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Accuri C6流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。使用的主要試劑盒包括Anti-human Percpcy5.5-CD4試劑盒(美國(guó)，Biolegend)、Anti-human AF488-CXCR5試劑盒(美國(guó)，BD)、Human-IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海，江萊生物技術(shù)有限公司)、Human-IL-21 ELISA試劑盒(上海，江萊生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1T1DM患者外周血淋巴細(xì)胞分離及處理 抽取所有研究對(duì)象外周血3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，磷酸鹽緩沖液(PBS)與全血按照1∶1比例稀釋，采用密度梯度離心法分離周圍淋巴細(xì)胞，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比 取細(xì)胞懸液100 μL于試管中，依次加入抗體Anti-human Percpcy5.5-CD4、Anti-human AF488-CXCR5，4 ℃、振蕩、避光、孵育30 min，洗滌，以300 μL冷PBS重懸，于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。所得數(shù)據(jù)用配套軟件進(jìn)行分析，在FSC-SSC圖上選定淋巴細(xì)胞群，然后以CD4和SSC設(shè)門分析CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比。

1.3.3T1DM患者血清中IL-6、IL-21水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-6、IL-21水平，嚴(yán)格按照Human-IL-6 ELISA試劑盒和Human-IL-21 ELISA試劑盒中的說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比比較 研究組、健康對(duì)照組中CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比分別為(23.8±0.68)%、(14.1±0.46)%，研究組明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組外周血IL-6、IL-21水平比較 研究組、健康對(duì)照組IL-6水平分別為(34.45±8.31)、(23.46±5.52)ng/L；研究組、健康對(duì)照組IL-21水平分別為(202.0±46.51)、(102.9±32.78)ng/L。研究組IL-6、IL-21水平均明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3T1DM患者CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比與血清IL-6、IL-21水平的相關(guān)性 采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，T1DM患者CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比與外周血血清IL-6、IL-21水平均呈正相關(guān)(r=0.449 2、0.572 9，P<0.05)，見圖1。

注：A為IL-21與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比相關(guān)分析；B為IL-6與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比相關(guān)分析。圖1 T1DM 患者血清IL-6、IL-21與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比的相關(guān)分析

3 討 論

T1DM是一種由遺傳易感性和環(huán)境危險(xiǎn)因素相互作用導(dǎo)致胰島β細(xì)胞被破壞，進(jìn)而造成胰島素分泌不足的自身免疫性疾病[6]。Tfh細(xì)胞是位于次級(jí)淋巴組織(SLOs)生發(fā)中心的可輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的CD4+T細(xì)胞，其特征性膜表面分子主要有程序性細(xì)胞死亡蛋白(PD-1)、趨化性細(xì)胞因子受體(CXCR5)、誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)等，具有輔助B細(xì)胞的功能，可參與生發(fā)中心的形成及B細(xì)胞發(fā)育、活化增殖與功能調(diào)節(jié)，也可為高親和力抗體的產(chǎn)生提供幫助，是機(jī)體適應(yīng)性免疫的重要組成部分，同時(shí)參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病[7-10]。

在自身抗體產(chǎn)生的過程中，生發(fā)中心中的Tfh細(xì)胞識(shí)別B細(xì)胞或B細(xì)胞所呈遞的抗原，通過CD40L、ICOS和OX40等共刺激，分子與細(xì)胞間產(chǎn)生穩(wěn)定的相互作用，在這種相互作用中，Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞互相依賴，并分泌IL-21、IL-4、IL-9和IL-10等效應(yīng)細(xì)胞因子，它們可促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)并可促使B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞[11]。

IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等生成，其作用靶細(xì)胞較多，是一種具有復(fù)雜生理功能的細(xì)胞因子。IL-6參與了多種生物學(xué)過程，如免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)，同時(shí)，低水平IL-6可促進(jìn)胰島素的分泌，高水平IL-6則可抑制胰島素分泌，但年齡、種族、病程則對(duì)血清IL-6水平無影響[12-14]。IL-21是Tfh 細(xì)胞活化后分泌的特征性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo) Tfh 細(xì)胞分化，促進(jìn)生發(fā)中心的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并產(chǎn)生不同類型的抗體。

在本研究中，研究組CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比、IL-6水平明顯高于健康對(duì)照組，且CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞與IL-6水平呈正相關(guān)。IL-6有兩條信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑，一條為IL-6與其受體膜蛋白結(jié)合，即與IL-6Rα相結(jié)合形成一種復(fù)合物；另一條則是IL-6與gp130膜蛋白相結(jié)合，使體內(nèi)對(duì)IL-6有反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量增加[15]。IL-21通過與生發(fā)中心B細(xì)胞表面或Tfh細(xì)胞自身表達(dá)的IL-21受體結(jié)合，促進(jìn)漿細(xì)胞分化產(chǎn)生大量抗體，誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞表達(dá)CXCR5并遷移至生發(fā)中心，維持T-B細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡[16]。血清中IL-4、IL-9與人體的免疫反應(yīng)具有一定的關(guān)系。IL-10也稱為細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，是一種多效性細(xì)胞因子，可以在多種類型細(xì)胞中發(fā)揮免疫抑制或免疫刺激的作用[17]。結(jié)合本研究可推測(cè)，T1DM自身免疫的發(fā)生原因?yàn)轶w內(nèi)IL-6大量增多，促使CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞的過量分化，并分泌IL-21，IL-21與CD4+CXCR5+ICOS+PD1+T細(xì)胞自身表達(dá)受體結(jié)合，輔助作用于B細(xì)胞的分化；同時(shí)，IL-4、IL-9、IL-10的分泌也會(huì)增多，其促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)并促使B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌蛋白酪氨酸磷酸酶抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細(xì)胞自身抗體、抗胰島β細(xì)胞抗體等多種自身抗體，損傷胰島細(xì)胞，造成胰島素分泌不足，進(jìn)而導(dǎo)致T1DM的發(fā)生。

綜上所述，IL-6可能促進(jìn)Tfh細(xì)胞的活化并分泌IL-21進(jìn)而輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體參與T1DM的發(fā)生。但研究樣本量較小，還需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量，并結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。