劉世豫，田居靈，梁 靜（通信作者）,宋晨輝

（1 新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院輸血科 新疆 烏魯木齊 830002）

（2 烏魯木齊市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 新疆 烏魯木齊 830011）

（3 新疆醫(yī)科大學(xué)第六臨床醫(yī)學(xué)院 新疆 烏魯木齊 830011）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）感染引起，可通過攻擊患者免疫系統(tǒng)，將淋巴細(xì)胞大量吞噬，并破壞其合成，最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)崩潰。目前，AIDS 在人群中的傳染性極強(qiáng)，病死率較高，暫無有效的預(yù)防與治療手段，對患者的生命帶來巨大威脅。因此，HIV 的早期診斷就顯得極為重要，盡早發(fā)現(xiàn)感染者、切斷傳播途徑對抑制AIDS 的傳播具有積極的意義。但HIV 的檢測具有一定的特殊性，任何漏檢或誤檢均可對被檢者與社會造成重大的影響，因此，臨床篩查HIV 的方法需具有較高的敏感性與特異性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）因其簡便、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于HIV 篩查中。但ELISA 檢測方法存在著操作復(fù)雜、檢測周期長等缺點(diǎn)，可一定程度上影響檢測結(jié)果。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA）較ELISA 法較為快捷，且檢測的敏感性也較高，在HIV 篩查中具有一定的優(yōu)勢。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，ELISA 與ECLIA法檢測陰性也不能完全排除HIV 感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此關(guān)于兩種檢測方式的具體價(jià)值目前尚無定論?；诖?，本文旨在探討ELISA 法與ECLIA 法用于HIV 抗體檢測中的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年7 月—2021 年7 月新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院進(jìn)行HIV 抗體檢測的10 316 份血液樣本。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①受檢者存在艾滋病高危因素（如娛樂場所從業(yè)人員、男男同性戀、伴侶較多、與HIV 攜帶者性接觸等），疑似HIV 感染；②受檢者意識清晰，認(rèn)知功能良好；③受檢者既往未接受過相關(guān)的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①受檢者患有惡性腫瘤；②受檢者存在嚴(yán)重感染；③心、肝、腎等臟器功能不全者；④無效血液標(biāo)本或存在血液性疾病。受檢者中男5 977 例，女4 339 例；年齡18 ～65 歲，平均年齡（31.56±4.42）歲。

1.2 方法

儀器與試劑：ELISA 采用EL10A 型酶標(biāo)儀（濟(jì)南鑫貝西生物科技有限公司）及武漢伊艾博科技有限公司試劑；ECLIA 采用CIA 型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑（濟(jì)南歐萊波技術(shù)有限公司）。ELISA：（1）取受檢者清晨空腹外周肘靜脈血液6 mL，分別裝于2 個(gè)不同的試管內(nèi)，低溫保存待檢。（2）將1 支待檢血液，采用離心機(jī)（重慶三大偉業(yè)制藥有限公司），以3 000 r/min 速率離心10 min，取血清。（3）將酶標(biāo)板取出，設(shè)置為1孔樣品、1 孔空白對照、2 孔陰性對照、3 孔陽性對照模式，并對其進(jìn)行標(biāo)記；將對應(yīng)陽性、陰性對照品及樣品各100 μL 分別加入出空白孔外的其他每孔中。（4）置于37 ℃恒溫箱中經(jīng)30 min 孵育，孵育結(jié)束后，用洗板機(jī)洗板6 次，洗板洗滌液用量為400 μL 每孔每次，加洗滌液后需靜置10 s，洗板結(jié)束后，拍干殘余洗液。（5）每孔加入酶標(biāo)記抗原100 μL（空白孔除外），輕輕振蕩，蓋好封板膜，置于37 ℃恒溫箱中再次進(jìn)行30 min 孵育、6 次洗板及拍干后，加入底物液，進(jìn)行15 min 避光反應(yīng)后加終止液使反應(yīng)終止。（6）應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度（Absorbance, OD）值，cut-off 值=陰性對照OD均值+0.1，樣品OD 值＞cut-off 值為陽性。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，將檢測結(jié)果為陽性樣本送HIV 確認(rèn)中心確認(rèn)。ECLIA：（1）取另1 支待檢測樣品，采用離心機(jī)（重慶三大偉業(yè)制藥有限公司），以800 r/min 速率離心處理5 min，將樣品與生物素抗HIV-1p24 單克隆抗體孵育成抗原-抗體復(fù)合物。（2）將磁微粒應(yīng)用磁石收集好，將其中未反應(yīng)物質(zhì)除去，而后加抗HIV 抗原（經(jīng)堿性磷酸酶標(biāo)記）與磁微粒的HIV 抗體反應(yīng)。（3）再次將磁微粒應(yīng)用磁石收集好，將其中未反應(yīng)物質(zhì)除去，再加入發(fā)光底物后充分?jǐn)嚢?，使磁微粒分散，隨后添加清洗劑。檢測復(fù)合物發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算cut-off 值。結(jié)果確認(rèn)：將檢測結(jié)果為陽性樣本送HIV 確認(rèn)中心確認(rèn)（主要采用方法為蛋白印跡法）。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）檢測陽性率：統(tǒng)計(jì)并比較兩種檢測方法檢測陽性標(biāo)本數(shù)量。（2）初篩結(jié)果比較：觀察兩種方法檢測HIV 抗體濃度分布情況及與檢測結(jié)果符合率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 兩種HIV 抗體檢測方法陽性率、假陽性率比較

10 316 份檢測樣本中，ELISA 檢測出陽性樣本30 份，陽性率為0.29%（30/10 316）；ECLIA 檢測出陽性樣本28 份，陽性率為0.27%（28/10 316），ELISA 與ECLIA檢測陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；最終經(jīng)確認(rèn)中心確認(rèn)陽性樣本26 份。ELISA 法假陽性率15.38%（4/26）；ECLIA 法假陽性率7.69%（2/26）。兩種檢測方法假陽性率比較，無顯著差異（＞0.05）。見表1。

表1 兩種HIV 抗體檢測方法陽性率比較[n（%）]

2.2 兩種檢測方法初篩結(jié)果與確認(rèn)結(jié)果比較

ELISA 法檢測出陽性樣本的吸光度值/臨界值（OD/CO）多分布于1.35 ～1.80 范圍內(nèi)，確診符合率均值為83.61%；ECLIA 檢測出陽性樣本的臨界值（cutoff）多在150.00 ～220.00 范圍內(nèi)，確診符合率均值為89.58%。但兩種方法確診符合率均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 1.535，= 0.215），見表2、表3。

表2 ELISA 測定結(jié)果與確認(rèn)結(jié)果比較

表3 ECLIA 測定結(jié)果與確認(rèn)結(jié)果比較

3.討論

HIV 病毒屬于RNA 病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒克慢性毒屬，HIV感染者到疾病進(jìn)展至“全面暴發(fā)”的AIDS 前有一個(gè)較長的潛伏期，因此無癥狀HIV 感染不易被發(fā)現(xiàn)，臨床干預(yù)較為困難，患者的病死率較高。因此，檢測HIV 感染、監(jiān)測病毒在患者體內(nèi)的復(fù)制情況、了解感染后病情的發(fā)展等對于病毒傳播的控制及用藥的指導(dǎo)等具有十分重大的意義。

目前，檢測HIV 抗體的常用方法包括ELISA 法及ECLIA 法。（1）ELISA 法是在不改變抗體的免疫學(xué)特性的情況下，酶分子與抗體或抗原的蛋白分子共價(jià)結(jié)合（該種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性），通過底物溶液的滴加，在酶的作用下使底物所含的供氫體發(fā)生還原反應(yīng)，呈現(xiàn)出顏色的變化，以此來判斷是否發(fā)生免疫反應(yīng)，具有一定檢測價(jià)值。（2）ECLIA 法將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，具有較高的靈敏度、特異度，被廣泛用于各種抗體、抗原、激素、酶等的監(jiān)測與分析中。且ECLIA 法具有線性范圍寬、線性擬合度好、操作快速簡便、不存在環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，能夠提高HIV 抗體檢測的準(zhǔn)確性，已逐步成為檢測的主流技術(shù)。但具體何種檢測方法價(jià)值更高還需探究。

本文結(jié)果顯示，通過ELISA 法與ECLIA 法檢測HIV抗體，樣本呈現(xiàn)陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示兩種檢測方式用于HIV 抗體檢測均可達(dá)到一定的符合率。分析原因可能為，（1）ELISA 法檢測的敏感性雖然較高，但該種方法需要游離抗原、抗體及結(jié)合狀態(tài)的抗原、抗體，因此需要反復(fù)加樣及洗板，操作相對復(fù)雜，且用于檢測的包被孔之間有時(shí)會因?yàn)榻徊嫖廴径霈F(xiàn)假陽性，導(dǎo)致檢測結(jié)果可能存在一定誤差。（2）ECLIA 將抗體（抗原）用法學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記，與待檢測樣本中相應(yīng)的抗原（抗體）和磁顆粒性抗體（抗原）發(fā)生免疫反應(yīng)后，以磁場的方式分離出不同狀態(tài)下的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，此時(shí)加入氧化劑和氫氧化鈉呈現(xiàn)堿性環(huán)境，吖啶酯即可在無催化劑的情況下分級、發(fā)光。但是，從HIV 感染到血清轉(zhuǎn)陽前的一段時(shí)期內(nèi)，通常會遇到檢測不出HIV 特異性抗體的窗口期，其時(shí)間長短因病毒的致病性和宿主的免疫應(yīng)答不同而異。因此，檢測HIV 的方法仍需繼續(xù)探討。

OD/CO 值cut-off 值越高，確認(rèn)符合率越高。本文結(jié)果還顯示，ELISA 法檢測出陽性樣本的吸光度值/臨界值（OD/CO）多分布于1.35 ～1.80 范圍內(nèi)，確診符合率均值為83.61%；ECLIA 檢測出陽性樣本的臨界值（cut-off）多在150.00 ～220.00 范圍內(nèi)，確診符合率均值為89.58%。但兩種方法確診符合率均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 1.535，= 0.215）。提示兩種檢測方式均對高濃度下HIV 抗體準(zhǔn)確率更高。這可能是因?yàn)楦邼舛认?，檢測試劑的反應(yīng)性更為強(qiáng)烈，因此檢測準(zhǔn)確度也相較提升。楊若男等收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院646 例患者篩查HIV 情況發(fā)現(xiàn)，ECLIA 診斷HIV 抗體的ROC 曲線下面積為0.990，cutoff 值32.17,靈敏度97.10%，特異度96.20%，CLIA 檢測值COI 越大，蛋白印跡法的陽性率越高。該結(jié)果可為采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測HIV 抗體的檢測策略提供重要的參考依據(jù)。本文結(jié)果與其一致，但在每次檢測中并不能排除無低濃度樣本的存在，因此兩種檢測方式呈現(xiàn)的陽性樣本需要送確認(rèn)中心進(jìn)行再次確認(rèn)。林琳等研究建議，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該用兩種方法同時(shí)進(jìn)行HIV 抗體檢測，以此排除不同試劑靈敏性差異的缺陷。因而，臨床HIV 抗體檢測時(shí)可考慮ELISA法與ECLIA 法聯(lián)合檢測，對提高檢測陽性率可能具有一定的意義。

綜上所述，ELISA 法與ECLIA 法用于HIV 抗體檢測中效果顯著，符合率較高，但兩種方法各有優(yōu)劣勢。無論是ELISA 法還是ECLIA 法檢測HIV 抗體，在結(jié)果報(bào)告時(shí)仍需參照患者的臨床進(jìn)行相應(yīng)的綜合分析，對檢測是否為陽性做出客觀的判斷，為明確是否隨訪、進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果等提供重要的參考依據(jù)。因時(shí)間限制，未對試驗(yàn)的條件進(jìn)行優(yōu)化和全面的評價(jià)，下一步擬優(yōu)化反應(yīng)條件，減少外界因素對檢測結(jié)果的影響。