徐慧香，王寧，張美霞，羅丹

（鄭州市第九人民醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450053）

支氣管哮喘是一種影響氣道的慢性炎癥性疾病，氣道重塑和氣道高反應(yīng)性在支氣管哮喘中發(fā)揮著重要作用［1］。此外，支氣管平滑肌細(xì)胞（bronchial smooth muscle cells,BSMC）增殖對(duì)氣道重塑有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，多項(xiàng)研究證據(jù)表明，支氣管平滑肌細(xì)胞增殖是氣道病理重塑的主要影響因素［2］。而且在體外，已顯示哮喘患者的支氣管平滑肌細(xì)胞具有明顯的超反應(yīng)表型，其特征在于通過(guò)增加促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)［3］，因此，支氣管平滑肌的變化對(duì)于過(guò)敏和炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)以及氣道壁重塑是必不可少的。白細(xì)胞介素（IL）-18 屬于IL-1 家族，參與了輔助型T 細(xì)胞（Th）2 誘導(dǎo)的多種炎癥反應(yīng)和免疫過(guò)程［4］。研究顯示，IL-18在哮喘急性發(fā)作患者的血清中明顯增加，但是IL-18 對(duì)BSMC 的影響尚不清楚［5］。Toll 樣受體4（TLR4）/髓樣細(xì)胞分化因子88（MyD88）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）易被炎性細(xì)胞因子激活，導(dǎo)致細(xì)胞炎性因子的增加，且哮喘患者顯示支氣管組織TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路被激活［6］。對(duì)此，本研究采用IL-18 刺激BSMC 增殖，并探討TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路是否參與其中。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人BSMC 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及試劑

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；IL-18（美國(guó)Sigma Aldrich 公司）；Eritoran（日本衛(wèi)材公司）；兔抗人TLR4、MyD88、NF-κB p65、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G 二抗（美國(guó)Sigma 公司）。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) BSMC 接種到含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代。

1.4.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 對(duì)數(shù)期密度為5×104個(gè)/mL BSMC 接種于96 孔板，100 μL/孔，24 h 貼壁后棄上清。加入（0.0、0.1、1.0、10.0 ng/mL）IL-18 分別刺激24、48、72 h 后，加入CCK-8 10 μL，培養(yǎng)2 h，于450 nm 測(cè)定OD 值（A），計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4.3 體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 1×106個(gè)/孔BSMC 接種于6 孔板中，加入（0、10 ng/mL）IL-18 分別刺激48 h 后，無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取100 μL 加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，簽刮凈濾膜上層細(xì)胞，Giemsa 染色，拍照計(jì)數(shù)。

1.4.4 Western blot 法 1×106個(gè)/孔BSMC 接種于6 孔板中，加入（0、10 ng/mL）IL-18 分別刺激48 h后，總蛋白常規(guī)提取，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)蛋白濃度。20 μL 蛋白樣品加樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。5%山羊血清封閉1 h，加入一抗（TLR4、MyD88、NF-κB p65 和β-actin 的稀釋比例分別為1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000 和1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)成像，并進(jìn)行灰度分析。

1.4.5 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞周期的影響 1×106個(gè)/孔BSMC 接種于6 孔板中，將細(xì)胞分成：對(duì)照組、IL-18 組、IL-18+Eritoran 組，其中IL-18 干預(yù)濃度為10 ng/mL，Eritoran 100 nmol/L。依據(jù)分組計(jì)劃，Eritoran 處理2 h 后，加入IL-18繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后，胰酶消化，1 000×g 離心3 min，加入1 mL 冰浴預(yù)冷70%乙醇中，70%乙醇固定24 h，1 000×g 離心3 min。1 mL 冰浴預(yù)冷PBS 洗滌后，1 000×g 離心3 min。加入0.5 mL 碘化丙啶重懸細(xì)胞，37℃避光溫浴30 min，使用流式細(xì)胞儀分析DNA 含量。

1.4.6 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 增殖、遷移及TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影響 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞分成：對(duì)照組、IL-18 組、IL-18+Eritoran 組。其中IL-18 干預(yù)濃度為10 ng/mL，Eritoran 100 nmol/L，依據(jù)分組計(jì)劃，Eritoran 處理2 h 后，加入IL-18繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞遷移，Western blot 法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，抑制率比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其余采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

表1 顯示，BSMC 細(xì)胞吸光度值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=7.290,P=0.000）；同時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=85.450,P=0.000）；并且分組與時(shí)間有交互作用（F交互=6.910,P=0.000）。其中1 ng/mL作用72 h，10 ng/mL 作用48 h、72 h 細(xì)胞活力增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中10 ng/mL 作用48 h、72 h 細(xì)胞活力最高。

表1 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響（n=3,±s,ng/mL）

表1 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的影響（n=3,±s,ng/mL）

注：1）與24 h 比較，P＜0.05；2）與24 h 比較，P＜0.01；3）與0 ng/mL 比較，P＜0.05；4）與0 ng/mL 比較，P＜0.01。

2.2 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

遷移實(shí)驗(yàn)提示，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（23.53±3.36）；IL-18 組細(xì)胞數(shù)為（78.34±4.62）；與對(duì)照組比較，IL-18 組的細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞遷移的影響（×200）

2.3 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞TLR4、MyD88和NF-κB p65 蛋白水平的影響

與對(duì)照組比較，IL-18 組TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平的影響

表2 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平的影響（n=3,±s）

表2 IL-18 對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平的影響（n=3,±s）

注：?與對(duì)照組比較，P＜0.01。

2.4 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞周期影響

與IL-18 組比較，IL-18+Eritoran 組G1 期細(xì)胞百分比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而S 期、G2 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞周期影響

表3 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞周期影響（n=3,±s,%）

表3 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞周期影響（n=3,±s,%）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.01；2）與IL-18 組比較，P＜0.01。

2.5 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 增殖、遷移及TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影響

與對(duì)照組比較，IL-18 組和IL-18+Eritoran 組的吸光度值明顯增加，細(xì)胞遷移數(shù)目明顯上調(diào)，TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與IL-18 組比較，IL-18+Eritoran 組吸光度值明顯降低，細(xì)胞遷移數(shù)目明顯下調(diào)，TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖4、圖5。

表4 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影響（n=3,±s）

表4 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影響（n=3,±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.01；2）與IL-18 組比較，P＜0.01。

圖4 體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（×200）

圖5 Eritoran 對(duì)IL-18 誘導(dǎo)BSMC 細(xì)胞TLR4、MyD88和NF-κB p65 蛋白水平的影響

3 討論

哮喘是一種慢性支氣管炎性疾病，包括支氣管的高反應(yīng)性和支氣管壁的局部炎癥/增厚，并導(dǎo)致黏液形成和支氣管收縮［6］。支氣管平滑肌細(xì)胞異常增生在氣道重塑中起重要作用，部分T 淋巴細(xì)胞與BSMC 附著誘導(dǎo)了BSMC 中的DNA 合成，從而增強(qiáng)了其增殖。BSMC 增殖的增強(qiáng)和BSMC 的凋亡減少可能導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性［7］。而且有文獻(xiàn)顯示，支氣管哮喘患者的支氣管平滑肌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子比正常人更多，包括一些常見(jiàn)的趨化因子配體［8］。這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)附著肥大細(xì)胞促進(jìn)肥大細(xì)胞的存活和增殖，促進(jìn)炎癥物質(zhì)的積累，增加平滑肌并導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。

有幾種細(xì)胞因子和趨化因子參與哮喘的病理生理學(xué)。細(xì)胞因子與其靶細(xì)胞的膜特異性受體結(jié)合并觸發(fā)改變這些靶細(xì)胞中基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［9］。目前，細(xì)胞因子被認(rèn)為是哮喘的治療靶點(diǎn)，并且一些特定的抗細(xì)胞因子，如IL-5 抗體，已被批準(zhǔn)用作嚴(yán)重哮喘的治療選擇［10］。IL-18 為IL-1 家族成員，主要由巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞或T 細(xì)胞產(chǎn)生，具有雙向作用，可以通過(guò)誘導(dǎo)分泌γ-干擾素（IFN-γ），提高Th1 免疫應(yīng)答。同時(shí)其還能誘導(dǎo)IgE，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)Th2 的分泌。而且哮喘急性發(fā)作的患者的血清中的IL-18 水平明顯高于健康對(duì)照組，且治療前血清IL-18 水平明顯高于治療后的水平［11］。這些都說(shuō)明IL-18 水平的增加可能與哮喘有關(guān)，并有可能參與了支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究中，結(jié)果證實(shí)了IL-18促進(jìn)了支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。

TLR4/MyD88/NF-κB 通路與炎癥的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，TLR4 的激活，誘發(fā)MyD88 啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以說(shuō)MyD88 在整個(gè)通路中扮演著重要的角色，是轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號(hào)的靶分子。NF-κB 為MyD88 下游的信號(hào)分子，通過(guò)對(duì)NF-κB 的激活，啟動(dòng)下游的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)［12］。在本研究中，結(jié)果顯示IL-18 促進(jìn)了TLR4/MyD88/NF-κB 通路信號(hào)分子的表達(dá)水平，加強(qiáng)了細(xì)胞的炎性反應(yīng)，從而誘導(dǎo)支氣管平滑肌的增殖。而采用TLR4/MyD88/NF-κB 通路抑制劑Eritoran 抑制TLR4 的表達(dá)水平，影響了MyD88 誘導(dǎo)下游的基因水平，降低NF-κB p65 表達(dá)水平，抑制NF-κB 的活化，降低促炎因子水平，協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)的活化，并阻斷了IL-18 誘導(dǎo)BSMC 的增殖和遷移。這些都說(shuō)明IL-18 通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB通路促進(jìn)了平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，IL-18 可能通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB通路中信號(hào)分子的表達(dá)，促進(jìn)了平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，這也為支氣管哮喘基因治療提供新的靶點(diǎn)。