曾雅婷，熊 桃，李紅葉

(浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058)

柑橘黑點(diǎn)病的病原菌為柑橘間座殼菌[(Faw.)Wolf]。柑橘果實(shí)、葉片和枝梢受到病原菌侵染時(shí)，表面產(chǎn)生突起的黑色小粒點(diǎn)，枝干表現(xiàn)為流膠和枯死癥狀，果實(shí)在貯藏期受到感染時(shí)出現(xiàn)褐色蒂腐。除了外，和也可引起柑橘褐色蒂腐，、、、和等也能夠?qū)Ω涕僦Ω稍斐晌：?，其中是屬的?yōu)勢(shì)病原真菌。Huang等從浙江、廣西、福建等9個(gè)柑橘重要產(chǎn)區(qū)收集到了121株菌株，基于形態(tài)學(xué)和ITS、1-、、系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定，其中107株被鑒定為。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，除外，在帶黑點(diǎn)的柑橘病組織上還分離出、、、和等多種菌株，但是是主要的致病菌。

盡管是柑橘上的間座殼菌中的優(yōu)勢(shì)病原菌，但在柑橘病組織上還存在著豐富多樣的種類，需要建立一套快速的分子檢測(cè)方法對(duì)柑橘黑點(diǎn)病病菌進(jìn)行準(zhǔn)確而快速的鑒定。傳統(tǒng)上對(duì)黑點(diǎn)病病菌的鑒定主要是通過形態(tài)學(xué)觀察、分類基因測(cè)序來判斷，但間座殼屬真菌在培養(yǎng)基上生長一般需要3～5 d，它們的培養(yǎng)性狀相似，如和、和等近似種在PDA培養(yǎng)基上的最初菌落顏色均為純白色，加大了鑒定的用時(shí)和難度。此外，該類真菌分生孢子的產(chǎn)生需要較長時(shí)間，使用傳統(tǒng)的鑒定方法效率較低，不符合快速鑒定病菌的要求。因此，早期建立一套快速的柑橘黑點(diǎn)病菌鑒定和檢測(cè)技術(shù)十分有必要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，利用真菌基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物在病原真菌的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。在真菌分子檢測(cè)中，大多檢測(cè)技術(shù)都是基于種間的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列開發(fā)的，如已報(bào)道大豆中的和的檢測(cè)，印楝枝枯病菌的鑒定和檢測(cè)，土壤中的檢測(cè)。但是ITS序列在有些物種間比較保守，的種間差異較小。Guo等嘗試通過基因序列設(shè)計(jì)小麥紋枯病菌()的特異性引物，但發(fā)現(xiàn)特異性不強(qiáng)。本研究比對(duì)了柑橘上的及其他14種真菌(spp.)的ITS序列，發(fā)現(xiàn)這些物種相似性也很高，不易把它們區(qū)分開來。因此，在病原菌的分子檢測(cè)中，尋找物種所特異的核酸序列是非常有必要的。是真菌中一種常見的管家基因，與ITS基因序列相比，具有更高的拷貝數(shù)，序列之間有足夠的變異位點(diǎn)可以設(shè)計(jì)引物對(duì)不同病原真菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增比較。如Guo等根據(jù)小麥紋枯病菌()的基因序列成功設(shè)計(jì)了病原菌的特異性引物，所建立的實(shí)時(shí)qRT-PCR方法能夠?qū)ν寥罉颖局械倪M(jìn)行定量檢測(cè)。

本研究使用MEGA軟件比對(duì)分析了柑橘黑點(diǎn)病菌及其他來源于柑橘上的14種真菌的ITS、1-、和4個(gè)位點(diǎn)的基因序列差異，發(fā)現(xiàn)在基因序列中差異最大，按照Guo等的方法，根據(jù)病菌基因設(shè)計(jì)了的特異性引物，并且建立了常規(guī)PCR和qRT-PCR的分子檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)疑似感染黑點(diǎn)病菌的柑橘樣品也進(jìn)行了檢測(cè)，為柑橘黑點(diǎn)病的診斷和防治奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株的種名、來源相關(guān)信息見表1，所有菌株均由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所園藝植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 供試菌株信息

1.2 供試菌株DNA提取

供試菌株于PDA平板上25 ℃培養(yǎng)1周(12 h光暗交替)備用，用無菌手術(shù)刀刮取菌絲，在無菌研缽中用液氮研磨成粉末狀，采用CTAB法提取DNA。所有DNA樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 D. citri特異性引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

在Genbank中下載(登錄號(hào)：KJ490395)與柑橘上的其他14種間座殼屬真菌如、、等(表1)病菌基因的部分序列，利用MEGA軟件分析比對(duì)，找到各個(gè)種內(nèi)保守而種間差異較大的變異區(qū)，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的特異性引物Dc-F/Dc-R，引物由北京擎科生物科技有限公司杭州分公司合成，預(yù)期擴(kuò)增目標(biāo)片段244 bp。在NCBI Genbank database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)內(nèi)使用primer-BLAST初步驗(yàn)證引物的特異性。采用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)的DNA及其近似種DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和qRT-PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。

常規(guī)PCR反應(yīng)體系20 μL，包括2×PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol·L)，模板DNA 1 μL(約45 ng)，加ddHO補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL，包括SYBR Green I Premix 預(yù)混酶10 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol·L)，模板DNA 1 μL(約45 ng)，加ddHO補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，然后65 ℃到95 ℃，每10 s上升0.5 ℃。qRT-PCR的每個(gè)樣品重復(fù)3次，通過熔解曲線判斷是否有唯一的吸收峰。

1.4 引物靈敏度檢測(cè)

將提取的的DNA按2.25倍依次稀釋至濃度為45、20、8.89、3.95、1.76、0.78、0.35、0.15、0.07、0.03 ng·μL，用所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和qRT-PCR擴(kuò)增，以ddHO作為對(duì)照，測(cè)定引物的靈敏度。

1.5 qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

使用梯度稀釋后的DNA作為模板(如1.4節(jié)所述)，在CFX96 qRT-PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次，以擴(kuò)增得到的Ct值(反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))為縱坐標(biāo)()，以DNA模板質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)()，用Excel軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 發(fā)病植株組織中病菌的快速檢測(cè)

為了驗(yàn)證能否從柑橘病組織中檢測(cè)到，以貴州省從江縣采集的10份疑似感染黑點(diǎn)病的柑橘葉片為材料，每份樣品組織取約200 mg，采用CTAB法提取總DNA，作為PCR反應(yīng)模板，使用特異性引物對(duì)10份典型黑點(diǎn)病樣品進(jìn)行常規(guī)PCR和qRT-PCR檢測(cè)，以浙江大學(xué)紫金港校區(qū)的溫室中健康植株葉片提取的基因組DNA作為陰性對(duì)照，純培養(yǎng)菌株的基因組DNA作為陽性對(duì)照，ddHO作為空白對(duì)照。按照1.3節(jié)所述常規(guī)PCR和qRT-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，每份樣品重復(fù)3次。其中qRT-PCR體系檢測(cè)結(jié)果以Ct值顯示，Ct值≤30表示該樣品為黑點(diǎn)病陽性，Ct值>30為陰性，Ct值越低，則表明含量越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性的驗(yàn)證與檢測(cè)

通過比對(duì)及其他真菌的基因的部分序列(圖1)，找到具有穩(wěn)定差異的序列，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的特異性引物Dc-F(5′-CCCTCGAGGCATCATTAC-3′)和Dc-R(5′-ATGTTGCAGATGGTCAAATGG-3′)。該引物擴(kuò)增片段長度為244 bp。在GenBank中使用primer-BLAST初步驗(yàn)證引物的特異性，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的引物序列僅能與GenBank中的序列完全匹配，表明引物為特異。采用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)所有供試菌株進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，3株基因組DNA樣品均擴(kuò)增出244 bp的目標(biāo)片段(圖2中的條帶1，7和13)，而其他近似種所提取的DNA和以ddHO為模板的對(duì)照均未擴(kuò)增出目標(biāo)片段。qRT-PCR結(jié)果同樣顯示，該引物對(duì)只有唯一的產(chǎn)物吸收峰(圖3)，表明設(shè)計(jì)的引物對(duì)具有高度的特異性。

圖1 Diaporthe citri與其近似種TUB基因的核苷酸序列比對(duì)

M，DNA 2 000 plus Marker；1，Diaporthe citri；2，D. biguttulata；3，D. unshiuensis；4，D. arecae；5，D. biconispora；6，D. sojae；7，D. citri；8，D. endophytica；9，D. hongkongensis；10，D. citriasiana；11，D. citrichinensis；12，Diaporthesp；13，D. citri；14，D. discoidispora；15，D. eres；16，D. subclavata；17，D. multigutullata；18，ddH2O。

圖3 引物對(duì)D. citri的qRT-PCR擴(kuò)增的熔解曲線

2.2 引物靈敏度的測(cè)定

利用梯度稀釋的的DNA使用特異性引物Dc-F/Dc-R分別進(jìn)行常規(guī)PCR和qRT-PCR的靈敏度測(cè)定。常規(guī)PCR電泳結(jié)果顯示到第6條，所對(duì)應(yīng)的模板濃度為0.78 ng·μL，表明在常規(guī)PCR條件下，應(yīng)用該引物最低可以檢測(cè)到0.78 ng·μL的病原菌DNA量(圖4)。在qRT-PCR條件下，應(yīng)用該引物對(duì)不同濃度梯度的模板DNA進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，發(fā)現(xiàn)第1～7條的Ct值呈線性關(guān)系，自第8條起Ct值>30，無線性關(guān)系，因此，可確定在qRT-PCR條件下，應(yīng)用該引物最低可以檢測(cè)到0.35 ng·μL的病原菌DNA量(圖5)。表明qRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度比常規(guī)PCR檢測(cè)方法更高。

M，DNA 2 000 plus marker; 1，45 ng·μL-1; 2，20 ng·μL-1; 3，8.89 ng·μL-1; 4，3.95 ng·μL-1; 5，1.76 ng·μL-1; 6，0.78 ng·μL-1; 7，0.35 ng·μL-1; 8，0.15 ng·μL-1; 9，0.07 ng·μL-1; 10，0.03 ng·μL-1; 11，0.01 ng·μL-1; 12，ddH2O。

1，45 ng·μL-1; 2，20 ng·μL-1; 3，8.89 ng·μL-1; 4，3.95 ng·μL-1; 5，1.76 ng·μL-1; 6，0.78 ng·μL-1; 7，0.35 ng·μL-1; 8，0.15 ng·μL-1; 9，0.07 ng·μL-1; 10，0.03 ng·μL-1;11，0.01 ng·μL-1; 12，ddH2O。

2.3 qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)梯度稀釋的的DNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示，熒光值增加時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)與DNA濃度對(duì)數(shù)梯度呈負(fù)相關(guān)性，得出循環(huán)數(shù)Ct值()與DNA模板質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值()的線性關(guān)系為：=-4.911 9+24.61，決定系數(shù)=0.987 1，線性關(guān)系良好。

圖6 qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 發(fā)病植株組織中病菌的快速檢測(cè)

對(duì)貴州省從江縣的10份典型柑橘黑點(diǎn)病樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)和qRT-PCR檢測(cè)。常規(guī)PCR檢測(cè)中(圖7)，3份樣品可擴(kuò)增出244 bp的特異性電泳條帶，而健康的柑橘葉片和陰性對(duì)照均無任何條帶出現(xiàn)，引起的黑點(diǎn)病陽性檢出率為30%；在qRT-PCR檢測(cè)中(圖8)，6份樣品的Ct值≤30，即為引起的黑點(diǎn)病陽性，陰性對(duì)照、空白對(duì)照的Ct值>30，陽性檢出率為60%，表明qRT-PCR可更好地檢測(cè)引起的黑點(diǎn)病。

M，DL2 000 plus DNA marker; 1，陽性對(duì)照(培養(yǎng)D. citri提取的DNA); 2～11，疑似黑點(diǎn)病病斑葉片; 12，ddH2O; 13，健康的柑橘葉片。

1，陽性對(duì)照(培養(yǎng)D. citri提取的DNA); 2～11，典型黑點(diǎn)病病斑的柑橘葉片; 12，ddH2O; 13，健康的柑橘葉片。

3 討論

正確鑒定病原菌是有效防治植物病害的前提，傳統(tǒng)的鑒定是以病原菌的形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，包括鏡檢發(fā)病部位的病原物，或分離培養(yǎng)病原物，以及致病性測(cè)定等環(huán)節(jié)。最近對(duì)屬內(nèi)種的界定，除應(yīng)用ITS外，還引入了1-、、和中的3個(gè)或5個(gè)位點(diǎn)序列，構(gòu)建聯(lián)合的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。我們比對(duì)了柑橘上來源的15種真菌的ITS、1-、和4個(gè)位點(diǎn)序列，發(fā)現(xiàn)基因序列在種間的差異最大。因此，選擇該基因序列設(shè)計(jì)黑點(diǎn)病菌的特異性引物對(duì)Dc-F/Dc-R，開展常規(guī)PCR和qRT-PCR的檢測(cè)技術(shù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dc-F/Dc-R能很好地區(qū)分和來源于柑橘的14種真菌，特異性強(qiáng)。Chaisiri等發(fā)表了基于基因序列篩選和開發(fā)的常規(guī)PCR鑒定技術(shù)，與之相比，本文報(bào)道的引物序列和Chaisiri等發(fā)表的不同，本文不僅建立了的常規(guī)PCR檢測(cè)方法，還建立了的qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)，并且利用所建立的分子檢測(cè)體系對(duì)典型感染的帶病葉片進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)所設(shè)計(jì)的引物能夠用于的分子鑒定和檢測(cè)。

應(yīng)用常規(guī)PCR和qRT-PCR檢測(cè)帶病葉片的時(shí)其檢出率分別只有30%和60%。分析其原因，一方面是弱寄生菌，生活史中的大部分時(shí)間都是在枯梢與枝干的壞死組織中度過，在這些死亡的組織中生長和繁殖，無性繁殖產(chǎn)生分生孢子器，釋放的分生孢子通過雨水飛濺和沖刷等途徑傳播，有性繁殖產(chǎn)生的子囊孢子通過氣流傳播，當(dāng)著落在新生的葉片，枝梢和果實(shí)表面時(shí)，如果條件(主要是溫濕度)適宜，即萌發(fā)成芽管，侵入植物表皮組織，誘發(fā)寄主細(xì)胞產(chǎn)生防御反應(yīng)，分泌植保素6，7-二氧甲基香豆素(6，7-dimethoxy coumarin，scoparone)等抗菌物質(zhì)，被菌絲侵入的表皮細(xì)胞褐化壞死，隨后該壞死細(xì)胞周圍3～5層表皮細(xì)胞也隨著褐化壞死。同時(shí)在激素的作用下，壞死細(xì)胞周圍細(xì)胞非正常分裂增生、伸長、膨大，形成約10～12層細(xì)胞組成的半球狀愈傷組織，最后壞死細(xì)胞與愈傷組織間形成周皮，使壞死細(xì)胞與健康組織在組織結(jié)構(gòu)上分隔開，限制病菌的擴(kuò)展并保護(hù)健康組織正常生理活動(dòng)。因此，推斷發(fā)病組織中的菌絲含量低(在實(shí)際分離培養(yǎng)中，從很多小粒點(diǎn)上分離不到，在貯運(yùn)期也未發(fā)現(xiàn)果實(shí)自小粒點(diǎn)開始腐爛的現(xiàn)象)是檢測(cè)率不高的原因之一。另一方面，雖然是優(yōu)勢(shì)種，但從帶病的小粒點(diǎn)上還分離出屬中的、、、和等，此外，葉點(diǎn)霉屬等真菌也會(huì)影響黑點(diǎn)病癥狀。雖然尚未對(duì)這些種開展是否可以誘導(dǎo)小粒點(diǎn)產(chǎn)生的致病性驗(yàn)證，但也不能排除待測(cè)帶病葉片上的黑點(diǎn)病癥狀是由其他的真菌或其他屬的真菌引起。

本研究突破以往的利用ITS序列設(shè)計(jì)屬真菌檢測(cè)的引物，而是基于及其近似種基因序列之間的差異設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物Dc-F/Dc-R，并且建立了常規(guī)PCR和qRT-PCR檢測(cè)方法。該方法對(duì)鑒定十分有效，對(duì)田間病害診斷具有參考價(jià)值。