楊 玲，沙楠景，潘鵬舉，吳伯志

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省高校林木生物技術(shù)重點實驗室(西南林業(yè)大學(xué))，云南 昆明 650224)

鐵線蓮(spp.)是毛茛科鐵線蓮屬植物，花朵色澤艷麗，花型雍容大方，具有極高的觀賞價值，享有“藤本皇后”的美譽，深受歐洲、美國、新西蘭等國消費者喜愛，在國際市場上需求旺盛。經(jīng)過國外育種家改良的鐵線蓮品種進入中國后，其千姿百態(tài)的造型和色彩豐富的花朵，迷倒了無數(shù)的花卉愛好者，尤其是近年來伴隨著生活水平的提高，人們對觀賞型鐵線蓮的市場需求量不斷增加。

2019年在云南省昆明市大棚里盆栽種植的鐵線蓮發(fā)生了一種新病害：植株葉片受害后產(chǎn)生病斑，病健界限明顯；發(fā)病嚴重時大部分葉枯萎呈灰黑色，莖枝頂端枯萎，極大降低了鐵線蓮的觀賞價值并影響鐵線蓮生長，為擴大栽培帶來嚴重危害。經(jīng)查閱資料，并未查找到關(guān)于該病的記錄。在鐵線蓮的引種和栽培過程中，鐵線蓮最常見病害有枯萎病、白粉病、白絹病、根腐病等。為了明確鐵線蓮這一新病害的病原菌種類和為防控措施的制定提供理論依據(jù)，本研究從自然患病植株中進行了病原菌的分離、鑒定，并對其主要生物學(xué)特性進行了研究，以期為當?shù)罔F線蓮葉枯病的防控和深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及癥狀觀察

2019年4—6月，對發(fā)生此病害的鐵線蓮植株進行觀察和記錄；并從其中2株癥狀典型的病株上各采集還有健全組織的病葉3片用于病原菌的分離鑒定。

1.2 病原菌的分離純化

用組織分離法從自然患病植株的病葉分離病原菌，剪取病健交界處的小葉塊，用0.1% HgCl消毒5 min并用無菌水充分沖洗后，置于PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。同時設(shè)置對照處理，即將處理好的小葉塊放置于另一培養(yǎng)基上，分正、反面分別在平板的左右兩半平貼一下，再取出接種到分離培養(yǎng)基上。將平板放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待菌落長出后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲，轉(zhuǎn)移到 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并多次重復(fù)這樣的操作直至得到外觀一致的純菌落，并把菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1.3 回接驗證

以鐵線蓮靈感品種為回接材料。葉片用75%乙醇消毒并針刺處理，用5 mm無菌打孔器從活化培養(yǎng)了3 d的菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到回接株葉片上，以接種空白瓊脂的植株為對照，套袋保濕。每處理1盆，3次重復(fù)，于(25±2)℃實驗棚內(nèi)養(yǎng)護。每天觀察，并在植株發(fā)病后，按照科赫法則，從患病部位再次進行病原菌的分離純化和形態(tài)學(xué)觀察，確認其是否和接種的試驗菌株一致。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察

用5 mm無菌打孔器從活化培養(yǎng)了3 d的菌落邊緣打取菌餅，接種至 PDA 平板中心位置，置于25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察并記錄菌落的大小、形態(tài)以及菌落正反面顏色等菌落形態(tài)特征。并于PDA、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)上和接種于鐵線蓮組培苗上誘導(dǎo)產(chǎn)孢。待產(chǎn)孢后，用解剖針挑取產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)鏡檢，同時徒手切片觀察其內(nèi)部特征及觀測孢子的顏色、形態(tài)、大小等顯微特征。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

將活化培養(yǎng)的菌株樣品委托至北京擎科生物技術(shù)有限公司昆明分公司進行ITS、LSU序列測定，PCR擴增引物分別為ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和LROR(5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′)、LR5(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)。測序結(jié)果通過BLAST在線比對，將比對結(jié)果利用PhyloSuit軟件(v1.2)進行剪切、雙基因序列串聯(lián)和聯(lián)合分析，構(gòu)建最大似然法(ML)系統(tǒng)發(fā)育樹，用FigTree軟件(v1.4.2)進行樹形整理。

1.5 病原菌生物學(xué)特性研究

1.5.1 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

將菌餅分別接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基(MA)、查氏培養(yǎng)基(Czapek)上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.5.2 不同溫度對病原菌生長的影響

菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培養(yǎng)。

1.5.3 不同光照處理對病原菌生長的影響

菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，在光照強度3 000 lx下，用全光照、全暗和12 h/12 h光暗交替3種處理。

1.5.4 不同pH值對病原菌生長的影響

用常規(guī)酸堿調(diào)節(jié)液將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，將菌餅分別接種于其上，25 ℃培養(yǎng)。

1.5.5 碳源和氮源對病原菌生長的影響

采用查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測定碳源營養(yǎng)時，以葡萄糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉為供試碳源分別等量替換查氏培養(yǎng)基中的蔗糖；測定氮源營養(yǎng)時，以硫酸銨、牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨為供試氮源分別等量替換查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，測定其對病原菌生長的影響。

對病原菌生物學(xué)特性的處理均接種活化培養(yǎng)3 d的5 mm菌餅，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)至5 d時，用直尺十字交叉法測量菌落生長直徑。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用OriginPro8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉枯病癥狀

經(jīng)調(diào)查，該大棚種植的鐵線蓮有19.05%的植株受此病危害。發(fā)病植株葉緣或葉尖褪綠變成灰黑色，病斑大小不一，病健交界明顯，病斑邊緣深褐色；隨著病情發(fā)展，病斑擴展連成一片，大部分葉枯萎；莖枝頂端枯萎(圖1-A)。根據(jù)癥狀，初步診斷此病是葉枯病。

2.2 病原菌分離培養(yǎng)結(jié)果與回接驗證

從樣品中分離得到5株菌，其純培養(yǎng)菌落形態(tài)各不相同。將菌株活化后分別接種于健康鐵線蓮盆栽苗上，發(fā)現(xiàn)接種了Huahuo19-2菌株的植株在8 d后，均出現(xiàn)了以菌餅為中心的病斑，其癥狀與鐵線蓮葉枯病自然發(fā)病癥狀相同：病斑為灰黑色，其邊緣深褐色，隨著時間的延長病斑逐漸擴展(圖1-B)。對病葉取樣和進行分離培養(yǎng)，再次得到了形態(tài)相同的菌株。對照植株未出現(xiàn)上述癥狀(圖1-C)。因此可以確認，菌株Huahuo19-2為鐵線蓮葉枯病的病原菌。

A，自然發(fā)病植株的癥狀；B，回接植株發(fā)病癥狀；C，對照。

2.3 病原菌的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

培養(yǎng)初期為稀疏的白色菌絲，2 d后菌絲變密集并以輻射狀形式向四周快速延伸，菌落白色絲絨狀，邊界不明顯。第5天時，菌落直徑為(75.20±1.65)mm，菌落中心位置的菌絲開始倒伏凹陷，并出現(xiàn)色素沉積變成灰橄欖色(圖2-A)；菌落背面顏色比正面深(圖2-B)。8 d可長滿培養(yǎng)皿，此時菌落呈灰橄欖色至褐橄欖色，菌落背面顏色呈鉛灰色至灰黑色。

A，第5天菌落的正面；B，第5天菌落的背面；C，松散聚集的分生孢子器；D，分生孢子器；E，分生孢子；F，產(chǎn)孢細胞及幼嫩的孢子。

分離菌株在PDA、OA培養(yǎng)基上難以產(chǎn)孢。接種到組培苗上可致病，且在病株莖葉上產(chǎn)生大量肉眼可見的黑色、顆粒狀、被菌絲包裹的結(jié)構(gòu)。經(jīng)壓片觀察，發(fā)現(xiàn)這些顆粒狀結(jié)構(gòu)為分生孢子器形成的松散集群，輕壓后離散為多個分生孢子器，并有大量孢子迸出(圖2-C)。切片后觀察，分生孢子器表面包裹著豐富的菌絲，單腔近球形；其大小為(205.78～375.81)μm ×(101.55～331.58)μm，平均大小為(282.94±59.57)μm ×(226.87±79.56)μm(=20)；腔壁厚，最內(nèi)層無色透明(圖2-D)。孢子形狀為橢圓形至近柱形，淺褐色至深褐色，部分為單孢；部分孢子在近中間處產(chǎn)生隔膜，隔膜處輕微縊縮(圖2-E)。孢子平均大小(19.86±3.02)μm×(8.75±1.59)μm，平均長寬比為2.35±0.46(=50)。在暗視野下可見密集、細小的芽狀產(chǎn)孢細胞(圖2-F)。剛形成的分生孢子無色透明，壁?。浑S著孢子發(fā)育成熟，顏色加深，壁變厚，并從產(chǎn)孢細胞上脫離(圖2-F)。

從試驗菌株的菌落培養(yǎng)特征和無性型形態(tài)特征(分生孢子器形狀、大小和分生孢子的形狀、顏色、大小、有無分隔、長寬比等)上看，符合葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的的形態(tài)特征。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將試驗菌株的 ITS和LSU基因序列提交至國家微生物科學(xué)技術(shù)中心(NMDC)，獲得登錄號NMDCN0000HPB、NMDCN0000JBF；將兩種序列在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)中進行BLAST比對，目標序列與的相似性分別為98.97%和99.84%。以(CBS110299)為外群，聯(lián)合ITS和LSU基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，所測菌株屬于，分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致；其未與參比菌株聚在一起，在系統(tǒng)發(fā)育樹上呈獨立的分支，反映其可能為潛在新種。

加粗表示模式菌株；★表示試驗所得數(shù)據(jù)；圖中斜杠前數(shù)值表示支持率，斜杠后數(shù)值表示自舉值。

2.4 病原菌的主要生物學(xué)特性

2.4.1 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

試驗菌株在供試的培養(yǎng)基上生長狀況差異顯著(圖4)，在PDA和PSA培養(yǎng)基上生長最快；其次是OA和查氏培養(yǎng)基；在MA培養(yǎng)基上生長較緩慢，培養(yǎng)5 d后菌落直徑為(52.1±1.84)mm。并且在MA培養(yǎng)基上氣生菌絲不發(fā)達，菌絲外觀顯得較緊密。

不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4.2 不同溫度對病原菌生長的影響

不同溫度條件下對病原菌生長的影響差異顯著(圖5)，試驗菌株在10～35 ℃呈現(xiàn)先升后降的生長變化，當溫度從15 ℃上升為20 ℃后，菌落生長急劇加快；當溫度高于30 ℃后，菌落生長速度驟然下降，說明20～30 ℃為該菌生長較適宜的溫度區(qū)，其生長最適溫度為25 ℃。低于5 ℃時生長受到嚴重抑制，停止生長；當溫度在40 ℃以上時，則不生長。

圖5 不同溫度對病原菌生長的影響

2.4.3 不同光照對病原菌生長的影響

試驗菌株在3種光照條件下均生長良好，暗培養(yǎng)條件下菌落直徑為(73.8±1.47)mm，光暗交替處理下菌落直徑為(75.1±1.31)mm，光照條件下菌落直徑為(75.3±1.08)mm，三者之間差異不明顯。這說明鐵線蓮葉枯病病原菌生長對光照要求不嚴格。

2.4.4 不同pH值對病原菌生長的影響

試驗菌株在供試pH值范圍內(nèi)均能生長(圖6)，表明其適應(yīng)性較強，但不同pH值對菌落生長影響差異顯著。在供試pH值范圍內(nèi)，當pH值小于5時，菌絲生長很緩慢。隨著pH值上升，菌絲生長速度明顯上升而后又逐漸下降；在pH值為6.5～7.5條件下，菌落生長最快，表明該范圍為病原菌生長最適pH值。當pH值大于8.5之后，菌落生長速度又急劇下降。以pH值7為中軸看，兩側(cè)曲線變化不一樣，顯示該菌對于堿性條件的耐受性相比在酸性條件下強。

圖6 不同pH值對病原菌生長的影響

2.4.5 碳源和氮源對菌絲生長的影響

從圖7可以看出，試驗菌株可利用的碳源、氮源種類多樣，在供試的6種碳源和5種氮源下均能生長，但不同處理間差異顯著。其中，在以蔗糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑分別為(58.5±1.27)mm和(57.3±1.36)mm；在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢。說明蔗糖和葡萄糖是鐵線蓮葉枯病病原菌的最佳碳源。在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑達(57.8±1.87)mm；其次是以酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基；再次是以牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基；在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長最慢，培養(yǎng)5 d后菌落直徑僅有(27.4±1.02)mm。這表明，硝酸鈉是菌株生長的最適氮源。

A，碳源對病原菌生長的影響；B，氮源對病原菌生長的影響。

3 結(jié)論與討論

在形態(tài)上，分生孢子初時透明無色，隨著發(fā)育成熟變成深色，壁加厚并形成分隔，符合的形態(tài)特征。通過比較發(fā)現(xiàn)，試驗菌株與Zhang在云南新發(fā)現(xiàn)的兩種病菌、都產(chǎn)生深色的分生孢子，孢子有1分隔并在隔膜處稍有縊縮，均只發(fā)現(xiàn)了無性型而未觀察到有性型。除以上相似點外，這三者有較大差別，培養(yǎng)10 d后由白色逐漸變?yōu)殚蠙旎疑?，分生孢子平均大小?19.7±1.5)μm×(8.7±0.9)μm，長寬比2.2±0.2；培養(yǎng)約4周后由白色變?yōu)樗{綠色或橄欖灰色，分生孢子平均大小為(20.3±1.5)μm×(8.9±0.9)μm，長寬比2.3±0.2；而試驗菌株菌落顏色改變較早，培養(yǎng)4 d后由菌落中央開始變成灰橄欖色，其分生孢子與相比顯得略寬和長一些，但又比的略窄和短，平均大小為(19.86±3.02)μm×(8.75±1.59)μm，長寬比為2.35±0.46。此外，寄主也不同，來自于側(cè)柏，的寄主植物包括山茶花、厚皮香、三角槭、枳殼等，而試驗菌株的寄主植物為鐵線蓮。結(jié)合ITS和LSU序列所做的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，試驗菌株與、分別位于不同的分支，可見，這三者是不同的物種。通過系統(tǒng)發(fā)育分析可看出，相對于其他參比菌株，試驗菌株與關(guān)系較近，不過這兩者的形態(tài)學(xué)特征區(qū)別明顯。的分生孢子通常基部截形，且比試驗菌株的分生孢子更大。另外，從寄主和生境來看也明顯不同，寄生于木麻黃、柑橘、桉樹、山核桃等多種植物上，分布于西班牙和伊朗南部等地，在生境和寄主方面也沒有相同的地方。

真菌主要危害木本植物，可致潰瘍病、枝枯和葉枯、花果枯萎和腐爛、頂梢枯死等多種病害，在世界多地被發(fā)現(xiàn)，其寄主植物有金合歡、木麻黃、桉樹、核桃、柑橘、杏、葡萄、枇杷、廣玉蘭、榆樹等。國內(nèi)分別在陜西和云南等地發(fā)現(xiàn)有楊樹、側(cè)柏、厚皮香、山茶花等受危害，從草本植物中分離到為首次發(fā)現(xiàn)。本研究明確了鐵線蓮葉枯病病原菌的生物學(xué)特性，可為后期對此病的監(jiān)測和綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。試驗研究表明，鐵線蓮葉枯病病原菌可在10～35 ℃溫度范圍內(nèi)生長，生長的最適溫度為25 ℃，這與同樣分布于云南的和的溫度要求一致，這可能與地形、氣候等自然環(huán)境因素有關(guān)。鐵線蓮葉枯病病原菌可耐受的pH值范圍為4～10，最適pH值是6.5～7.5，這或許與其寄主鐵線蓮適宜在微酸性至微堿性的土壤環(huán)境中生長有關(guān)。在供試的不同培養(yǎng)基和6種碳源及5種氮源下均能生長。以上生物學(xué)特性研究表明，鐵線蓮葉枯病病原菌適應(yīng)能力強，營養(yǎng)來源廣泛且有耐高溫的特性。

隨著國內(nèi)新興的鐵線蓮消費熱的興起，北京、上海、浙江等地多家公司從歐洲多國引進鐵線蓮種苗來供應(yīng)國內(nèi)市場。云南省自20世紀末就在專業(yè)團隊的努力下，著手進行鐵線蓮新優(yōu)品種引種、種苗快繁和成品花實驗性生產(chǎn)，為進行鐵線蓮產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)做準備。據(jù)惠農(nóng)網(wǎng)(https：//news.cnhnb.com)報道，2016年起已有30余個園藝品種在大理、昆明等地進行小規(guī)模試種。為了有效控制鐵線蓮葉枯病在云南省的發(fā)展和蔓延，以及避免此病對鐵線蓮花卉的擴大栽培造成的潛在威脅，建議加強苗木養(yǎng)護管理，及時清除銷毀病枝和病株，并對該病的發(fā)生機制及防治措施進行深入的研究。