呂 倩，駱 巧，羅 雪，陳久兵，馬 莉，羅正中，姚學(xué)萍，余樹民，沈留紅，曹隨忠，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 404155)

奶牛乳房炎是影響奶牛健康的主要疾病之一，患病奶牛產(chǎn)奶量降低，乳汁品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益和人類的食品安全。引起奶牛乳房炎的病原菌主要有傳染性病原菌和環(huán)境性病原菌，傳染性病原菌主要有金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、支原體等。環(huán)境性病原菌主要有大腸埃希菌、乳房鏈球菌、棒狀桿菌等。最新研究證明，無(wú)乳鏈球菌等傳統(tǒng)觀念上的傳染性病原菌也可能是環(huán)境性病原菌，奶牛乳房炎的問題正在由傳染性乳房炎向環(huán)境性乳房炎轉(zhuǎn)變。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降時(shí)，乳房免疫系統(tǒng)不能抵御環(huán)境性病原菌的攻擊，環(huán)境性病原菌進(jìn)入乳頭，最終引起乳房炎。就環(huán)境因素而言，奶牛生活環(huán)境中最常接觸的便是它們的居住地-臥床墊層，那么環(huán)境性病原菌是否有可能直接來自臥床墊層？ Wu等通過對(duì)乳汁、臥床墊層、水樣等進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳汁微生物菌群與臥床墊層的微生物菌群有關(guān)聯(lián)?；诖耍粝肓私猸h(huán)境性病原菌是否直接來自臥床墊層，需先清楚臥床墊層的群生物菌群結(jié)構(gòu)。奶牛場(chǎng)常見的臥床墊層為沙土墊層、橡膠墊、秸稈與木屑、牛糞墊層或生物墊層，其中沙土墊層是普遍認(rèn)可的牛床墊層材料，具有清潔奶牛身體，不利于病原菌生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)；橡膠墊具有鋪設(shè)方便、維護(hù)簡(jiǎn)單、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。

本研究以16S rRNA基因的V4高變區(qū)作為分子標(biāo)記，利用Illumina Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)四川省兩規(guī)?；膛?chǎng)的臥床墊層樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，探究沙土墊層與橡膠墊層微生物菌群的結(jié)構(gòu)和組成，并對(duì)兩者之間的群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，旨在為奶牛場(chǎng)臥床墊層材料的選擇以及奶牛乳房炎的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

經(jīng)前期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩個(gè)奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎發(fā)病時(shí)間主要集中于夏季，發(fā)病率最高月份為7—9月。故于2019年7—9月的每月最后一天從四川省成都市某規(guī)?；膛?chǎng)(F1：總存欄荷斯坦奶牛1 500頭，泌乳牛存欄1 000頭，臥床墊料為風(fēng)干河沙)和四川省資陽(yáng)市某規(guī)?；膛?chǎng)(F2：總存欄荷斯坦奶牛2 000頭，泌乳牛存欄1 200頭，臥床墊料為橡膠墊)分別隨機(jī)采集泌乳牛臥床墊料混合樣本，兩奶牛場(chǎng)均為自由臥欄式牧場(chǎng)。臥床墊層選擇標(biāo)準(zhǔn)及清潔標(biāo)準(zhǔn)見表1。在臥床清理前，使用“四點(diǎn)法”采集非相鄰泌乳牛臥床后三分之一區(qū)域(乳房躺臥區(qū))樣本(圖1)，其中：墊沙采集厚度為3 cm，樣本編組為F1沙土；橡膠墊采集的樣本為泥狀殘留物，樣本編組為F2橡膠墊；各采集6份，每份50 g。所有樣本置于附有冰袋的保溫箱內(nèi)，立即送回實(shí)驗(yàn)室，超低溫(-80 ℃)冰箱中保存?zhèn)溆?。在牛舍安裝電子溫濕度計(jì)(鄭州，博洋儀器儀表有限公司)獲取02:00、08:00、14:00、20:00 4個(gè)時(shí)間段牛舍內(nèi)溫度、濕度數(shù)據(jù)。

圖1 臥床采樣點(diǎn)分布圖

表1 臥床墊層選擇標(biāo)準(zhǔn)及清潔標(biāo)準(zhǔn)

1.2 細(xì)菌總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

每份墊層混合樣本取300 mg，按照Meta類樣本的操作步驟提取細(xì)菌的總DNA；將得到的總DNA為模板對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如下：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.3 高通量測(cè)序

將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%濃度的瓊脂糖凝膠在150 V電壓下電泳40 min，檢測(cè)合格后使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。通過華大基因Illumina Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)后進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用FLASH和USEARCH軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過濾，得到優(yōu)化序列，將相似度為97%的有效序列進(jìn)行操作分類單元聚類，并挑選出相對(duì)豐度最高的序列作為每個(gè)OTUs的代表性序列。利用RDP classifer(v2.2)軟件對(duì)每條代表性序列進(jìn)行物種注釋并構(gòu)建OTUs分類信息表，繪制在屬分類水平上的物種分布柱狀圖。選取豐度前十的物種，利用R語(yǔ)言繪制關(guān)鍵物種差異比較柱狀圖；計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)樣本的α多樣性和β多樣性。α多樣性由反映群落豐富度的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)及反映群落多樣性的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)進(jìn)行評(píng)估；由于不同樣本對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)(reads)數(shù)量差距較大，為了保證后期分析結(jié)果合理，使用R語(yǔ)言軟件繪制Chao指數(shù)多樣性稀釋曲線圖；β多樣性選擇加權(quán)遺傳距離矩陣計(jì)算，并進(jìn)行熱圖分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將所獲數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel處理，再用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，溫濕度使用單因素ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較，物種差異分析及多樣性分析使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛舍內(nèi)溫濕度參數(shù)

7—9月采樣期間兩奶牛場(chǎng)牛舍內(nèi)平均溫度與平均濕度如表2所示。其中，兩奶牛場(chǎng)7月份的平均溫度與平均濕度均無(wú)顯著性差異(>0.05)，其他月份均存在顯著性差異，故選擇7月份樣本進(jìn)行下一步的測(cè)序分析。

表2 兩奶牛場(chǎng)7—9月平均溫度和濕度

2.2 樣本測(cè)序結(jié)果

經(jīng)測(cè)序，兩個(gè)奶牛場(chǎng)的臥床墊層12個(gè)樣本共獲得1 499 070條原始序列，經(jīng)過濾后獲得1 443 818條優(yōu)化序列，將相似度為97%的有效序列進(jìn)行操作分類單元聚類(OTUs)，共得到2 311個(gè)OTUs(圖2)，其中沙土墊層樣本中特有570個(gè)OTUs，橡膠墊層樣本中特有577個(gè)OTUs，兩者之間共有1 164個(gè)OTUs。

圖2 OTUs 維恩圖

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 屬分類水平上物種組成分析

為了對(duì)測(cè)序所得有效序列進(jìn)行物種注釋，反映樣本間物種的變化情況，將在屬分類水平上進(jìn)行菌群組成柱狀圖分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1沙土墊層與F2橡膠墊層樣本優(yōu)勢(shì)菌屬相差較大，沙土墊層優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬()、海桿菌屬()、里氏桿菌屬()、棒狀桿菌()、節(jié)桿菌屬()，相對(duì)豐度分別為29.8%、13.4%、6.8%、3.6%、2.4%；橡膠墊層優(yōu)勢(shì)菌屬為棒狀桿菌屬()、藤黃單胞菌屬()、梭桿菌屬()、鹽單胞菌屬()、弧菌屬()，相對(duì)豐度分別為11.0%、5.2%、3.6%、3.2%、2.5%。

橫坐標(biāo)是樣本名稱(F1、F2代表場(chǎng)1和場(chǎng)2)，縱坐標(biāo)是注釋到的物種相對(duì)豐度。該分類水平未注釋到的合并為Unclassified，豐度在所有樣本均低于0.5%的物種全部合并成其他。

2.3.2 屬分類水平上物種差異分析

為了研究沙土墊層與橡膠墊層樣本的差異物種，選取豐度為前十的物種，展示在屬分類水平上每組的平均相對(duì)豐度以及差異檢驗(yàn)的顯著性，性，進(jìn)行關(guān)鍵物種差異比較柱狀圖，結(jié)果如圖4所示：沙土墊層樣本中不動(dòng)桿菌屬()、里氏桿菌屬()的相對(duì)豐度顯著高于橡膠墊層樣本(<0.05)，橡膠墊層樣本中梭桿菌屬()的相對(duì)豐度顯著高于沙土墊層樣本(<0.05)。

橫坐標(biāo)是豐度為前10的物種，縱坐標(biāo)是其相對(duì)豐度，*代表差異檢驗(yàn)的顯著性(如P<0.001，則用“***”標(biāo)記；如0.001≤P<0.01，則用“**”標(biāo)記；如0.01≤P≤0.05，則用“*”標(biāo)記；如果P>0.05，則不標(biāo)記)。

2.3.3 Alpha多樣性分析

為了研究沙土墊層和橡膠墊層樣本的微生物菌群的豐富度和多樣性，對(duì)兩組的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算和差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示：Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)在兩組之間差異均不顯著(>0.05)，說明沙土墊層與橡膠墊層的微生物菌群的豐富度與多樣性相似。其中兩種樣本的Chao指數(shù)多樣性稀釋曲線圖趨于平緩(圖6)，說明該樣本的采樣量足夠，能覆蓋大多數(shù)物種。

由下到上的五條線分別為：最小值，第一個(gè)四分位數(shù)，中位數(shù)，第三個(gè)四分位數(shù)和最大值。異常值以“。”表示。

橫坐標(biāo)代表測(cè)序數(shù)據(jù)量，縱坐標(biāo)代表Chao指數(shù)對(duì)應(yīng)的Alpha多樣性指標(biāo)。

2.3.4 β多樣性分析

為了探究沙土墊層和橡膠墊層樣本間的物種多樣性差異，基于樣本的 OTUs信息，計(jì)算樣本之間的加權(quán)遺傳距離矩陣，并進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果如圖7所示，沙土墊層與沙土墊層、橡膠墊層與橡膠墊層的進(jìn)化樹距離比沙土墊層-橡膠墊層樣本的進(jìn)化樹距離短，表明同種類型樣本的相似性大于不同種類型樣本，沙土樣本間的菌群差異大于橡膠墊層樣本。

指數(shù)越大，樣本間差異越大。進(jìn)化樹距離越近，樣本相似性越大。

3 討論

本研究中：沙土墊層樣本中不動(dòng)桿菌屬()、里氏桿菌屬()的相對(duì)豐度顯著高于橡膠墊層樣本(<0.05)，橡膠墊層樣本中梭桿菌屬()的相對(duì)豐度顯著高于沙土墊層樣本(<0.05)。采樣期間，兩奶牛場(chǎng)牛舍內(nèi)溫度、濕度均無(wú)顯著性差異，日常維護(hù)標(biāo)準(zhǔn)中僅有墊沙每日翻耕及添新沙，橡膠墊則5 a一換有差異，故引起墊沙和橡膠墊之間的微生物菌群差異的原因可能是臥床材料及更替周期的不同。

不動(dòng)桿菌廣泛分布于外界環(huán)境中，主要在水體及土壤中，易在潮濕環(huán)境中生存。沙土鎖水能力相比橡膠墊強(qiáng)，故不動(dòng)桿菌易在沙土中生存繁殖，引起沙土中的相對(duì)豐度顯著高于橡膠墊。鮑曼不動(dòng)桿菌和洛菲不動(dòng)桿菌是不動(dòng)桿菌屬的代表菌種，均為條件致病菌。鮑曼不動(dòng)桿菌不僅可致新生駒的敗血癥、奶牛乳房炎、水牛流產(chǎn)、鱖敗血癥，還能引起仔豬腹瀉。葛東紅等從江蘇某奶牛場(chǎng)隱性乳房炎奶牛的生牛乳樣品中分離出4株鮑曼不動(dòng)桿菌，周文君等同樣在重慶某牛場(chǎng)患乳房炎奶牛的乳汁分離出鮑曼不動(dòng)桿菌。洛菲不動(dòng)桿菌同樣能夠?qū)е聞?dòng)物的不同感染，可引起動(dòng)物感染的報(bào)道涉及犬的急性失明、新生駒敗血癥、魚的內(nèi)臟出血等，林杰等對(duì)29份外觀正常的奶牛生乳乳樣進(jìn)行乳品質(zhì)分析和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，10份乳樣中有4份檢測(cè)出洛菲不動(dòng)桿菌，且這4份乳樣體細(xì)胞數(shù)偏高。故引起奶牛乳房炎的條件致病菌鮑曼不動(dòng)桿菌和洛菲不動(dòng)桿菌是否有可能直接來自臥床墊層，需做進(jìn)一步的分離鑒定。奶牛場(chǎng)在選擇沙土作為墊層時(shí)，在奶牛乳房炎的預(yù)防中應(yīng)注意不動(dòng)桿菌的預(yù)防。

在沙土和橡膠墊的優(yōu)勢(shì)菌屬中發(fā)現(xiàn)：沙土墊層與橡膠墊層的優(yōu)勢(shì)菌屬中均含有棒狀桿菌屬。棒狀桿菌屬是廣泛分布于動(dòng)物的微生物群(包括人類微生物群)中，大部分被認(rèn)為是無(wú)害的，還有些在工業(yè)環(huán)境中是有用的，例如谷氨酸棒狀桿菌。而有些可能會(huì)導(dǎo)致疾病。其中常見感染牛的有干燥棒狀桿菌和牛棒狀桿菌，Vela等從患敗血癥豬的內(nèi)臟、患關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)、流產(chǎn)動(dòng)物子宮或胎兒以及乳房炎奶牛的奶中分離出干燥棒狀桿菌；牛棒狀桿菌常見于奶牛乳房感染中，與奶牛產(chǎn)奶量減少和乳房炎有關(guān)。Wu等研究奶牛瘤胃液、糞便、乳汁、臥床墊層、水、空氣中的粉塵的微生物群落多樣性中，發(fā)現(xiàn)在自動(dòng)擠奶系統(tǒng)中臥床墊層均存在棒狀桿菌屬，這與本研究結(jié)果一致，故引起奶牛乳房炎的條件致病菌如干燥棒狀桿菌和牛棒狀桿菌可能直接來自臥床墊層，但需進(jìn)一步研究證實(shí)。奶牛場(chǎng)無(wú)論是選擇沙土還是橡膠墊作為臥床墊層，在奶牛乳房炎的預(yù)防中均應(yīng)注意棒狀桿菌的預(yù)防。

引起奶牛乳房炎的環(huán)境性病原菌有大腸埃希菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、牛棒狀桿菌等，但在本次實(shí)驗(yàn)中，沙土墊層及橡膠墊層中均未發(fā)現(xiàn)埃希氏菌屬、鏈球菌屬、克雷伯氏菌屬等，僅發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬和棒狀桿菌屬。與周德平等在肉牛發(fā)酵床上發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬醋酸桿菌屬、金黃桿菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬、高溫放線菌屬、類芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、葡萄糖醋桿菌屬有差異。分析產(chǎn)生差異的原因可能是臥床類型及管理的不同所造成的。下一步我們將進(jìn)一步探究臥床墊層中鮑曼不動(dòng)桿菌、洛菲不動(dòng)桿菌、干燥棒狀桿菌和牛棒狀桿菌與奶牛乳房炎的關(guān)系。

Patel等研究了不同臥床墊層材料與臥床墊層細(xì)菌計(jì)數(shù)(bedding bacteria counts，BBC)、奶牛乳房衛(wèi)生、奶牛乳房健康、乳汁質(zhì)量間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)使用糞便固體作為臥床墊層材料，其臥床墊層細(xì)菌計(jì)數(shù)較高。Kristula等建議使用沙子作為墊層，認(rèn)為沙子可以減少條件致病菌的環(huán)境定植，但同時(shí)在墊沙中也發(fā)現(xiàn)了高濃度的大腸埃希菌、克雷伯氏菌，這與本研究不一致，產(chǎn)生差異的原因是不同的臥床管理造成的。臥床管理不善往往造成臥床墊層的高細(xì)菌計(jì)數(shù)，一旦與糞便混合，任何類型的臥床都成為病原菌的來源，決定細(xì)菌濃度的是牛舍環(huán)境而不是臥床墊層類型。故無(wú)論是選擇哪種類型的臥床墊層，奶牛場(chǎng)應(yīng)格外注意臥床墊層的管理。

本研究通過對(duì)奶牛場(chǎng)沙土墊層與橡膠墊層微生物菌群進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得了沙土墊層與橡膠墊層微生物菌群分布信息，為奶牛場(chǎng)臥床墊層材料的選擇提供參考數(shù)據(jù)，也為奶牛乳房炎的預(yù)防工作提供理論數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

沙土臥床與橡膠墊臥床的優(yōu)勢(shì)菌屬差異較大，沙土墊層優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬()、海桿菌屬()、里氏桿菌屬()、棒狀桿菌屬()、節(jié)桿菌屬(hrobacter)；橡膠墊層優(yōu)勢(shì)菌屬為棒狀桿菌屬()、藤黃單胞菌屬()、梭桿菌屬()、鹽單胞菌屬()、弧菌屬()。沙土墊層樣本中不動(dòng)桿菌屬()、里氏桿菌屬()的相對(duì)豐度顯著高于橡膠墊層樣本(<0.05)，橡膠墊層樣本中梭桿菌屬()的相對(duì)豐度顯著高于沙土墊層樣本(<0.05)，沙土墊層樣本與橡膠墊層樣本的豐富度與多樣性相似，沙土樣本間的菌群差異大于橡膠墊層樣本，同種類型樣本的相似性大于不同種類型樣本。