楊 倩，李召仁，鮮思美，2*，包濤濤，3，張 友，梁 倩，顧慶林

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔東南 556000)

羊傳染性膿皰皮炎，俗稱“羊口瘡(Orf)”，是由羊口瘡病毒(Orf virus，OrfV)引起的一種急性、接觸性人獸共患傳染病。OrfV通?？筛腥舅心挲g段的綿羊和山羊，羔羊的發(fā)病率高達(dá)100%[1]。其他各種反芻動物和哺乳動物，如駱駝、犬、貓以及人等均有OrfV感染的報告[2]。近年來，已有多個國家相繼報道OrfV感染病例[3～5]。在我國東北、西北以及中部等地區(qū)也均有Orf疫情暴發(fā)[2,6]。Orf疫情的暴發(fā)，制約了養(yǎng)羊場的經(jīng)濟(jì)效益，并為世界公共衛(wèi)生安全帶來巨大隱患。因此，建立針對OrfV快速、簡便的診斷方法，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種在恒溫條件下利用鏈置換DNA聚合酶實現(xiàn)核酸快速擴(kuò)增的方法[7]。2008年，KIATPATHOMCHAI等[8]首次引入橫向流動試紙條(lateral flow dipstick，LFD)用于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。該LAMP-LFD技術(shù)原理是將LAMP的上游內(nèi)引物5′端用生物素(biotin，BIO)標(biāo)記，然后在內(nèi)引物擴(kuò)增有效區(qū)段設(shè)計1條用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的DNA探針，LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，BIO標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與FITC標(biāo)記的探針特異性雜交，可以在5 min內(nèi)于LFD上完成顯色和結(jié)果判斷。該方法不依賴特殊儀器設(shè)備，僅需水浴鍋或加熱器即可快速檢測目的基因，大大節(jié)省了檢測成本和時間，適用于基層及現(xiàn)場使用。目前，該LAMP-LFD技術(shù)已成功應(yīng)用于多種病原的檢測[9-11]，但對OrfV的LAMP-LFD檢測尚未見報道。

本研究根據(jù)OrfV的B2L基因保守區(qū)段設(shè)計1套LAMP引物和1條FITC標(biāo)記探針，通過各反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了OrfV的LAMP-LFD檢測方法，同時與常規(guī)PCR在敏感性和臨床樣本的檢出符合率方面進(jìn)行比較研究，旨在為臨床OrfV感染的診斷提供一種新型的快速檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要材料pMD18-T-B2L重組質(zhì)粒，口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)O型、亞洲Ⅰ型二價滅活疫苗，山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)，絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)，小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)，29份疑似Orf病料均由貴州大學(xué)動物疫病研究室保存。

1.2 主要試劑Bst DNA 2.0聚合酶購自NEB公司；橫向流動試紙條購自Millenia Biotec GmbH公司；dNTP Mix、DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；RevertAidTM預(yù)混液購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank登錄的OrfV-B2L的基因序列(Gu320351)，利用在線軟件Primer Explorer 4.0，設(shè)計用于LAMP擴(kuò)增的外引物OrfV-F3/OrfV-B3、內(nèi)引物OrfV-FIP/OrfV-BIP 4條特異性引物，在上游內(nèi)引物OrfV-FIP的5′端用BIO標(biāo)記；同時設(shè)計合成1條經(jīng)FITC標(biāo)記的特異性探針OrfV-HP，用于LFD的雜交試驗(表1，圖1)。以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。同時引物OrfV-F3/OrfV-B3用于普通PCR擴(kuò)增的特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增片段長度約為211 bp。

圖1 LAMP-LFD引物設(shè)計示意圖

表1 引物信息

1.4 核酸提取根據(jù)質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取pMD18-T-B2L質(zhì)粒DNA；根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取GTPV和Mmc的DNA；根據(jù)RNA提取試劑盒提取FMDV和PPRV的RNA，同時將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；將所提取的DNA/cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LAMP-LFD反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

1.5.1溫度優(yōu)化 25 μL LAMP反應(yīng)體系：1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U/μL)，2.5 μL 10×等溫擴(kuò)增緩沖液，3.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)，OrfV-F3/OrfV-B3(20 μmol/L)各2 μL，OrfV-FIP/OrfV-BIP(5 μmol/L)各1 μL，2 μL DNA模板，以及8.5 μL ddH2O。將以上混合物在反應(yīng)溫度61～66℃依次遞增下擴(kuò)增1 h后，經(jīng)80℃熱激5 min終止反應(yīng)。產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(AGE)檢測，依據(jù)擴(kuò)增效果以確定最佳退火溫度。

1.5.2時間優(yōu)化 在最佳反應(yīng)溫度下，其他條件不變，反應(yīng)時間按10，20，30，40，50，60 min優(yōu)化，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% AGE檢測，依據(jù)擴(kuò)增效果確定最適反應(yīng)時間。

1.5.3內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化 通過控制變量法，設(shè)置內(nèi)外引物濃度比為1∶1，2∶1，4∶1，8∶1，16∶1進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% AGE檢測，依據(jù)擴(kuò)增效果確定最佳內(nèi)外引物濃度比。

1.5.4聚合酶濃度優(yōu)化 通過控制變量法，設(shè)置Bst DNA 2.0聚合酶濃度分別為80，160，240，320，400，480 U/mL進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% AGE檢測，依據(jù)擴(kuò)增效果確定最佳聚合酶濃度。

1.5.5dNTP Mix濃度優(yōu)化 通過控制變量法，設(shè)置dNTP Mix濃度分別為0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mmol/L 進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% AGE檢測，依據(jù)擴(kuò)增效果確定最適dNTP Mix濃度。

1.5.6Mg2+濃度優(yōu)化 通過控制變量法，設(shè)置Mg2+濃度分別為2，4，6，8，10，12 mmol/L進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% AGE檢測，依據(jù)擴(kuò)增效果確定最適Mg2+濃度。

1.5.7LFD檢測條件的優(yōu)化 利用已確立的LAMP反應(yīng)體系及條件，使用BIO標(biāo)記的OrfV-FIP進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后不經(jīng)過80℃ 5 min 的終止反應(yīng)，而在反應(yīng)中加入20 pmol的OrfV-HP探針，分別在63，64，65℃雜交5 min，取雜交后產(chǎn)物5 μL加入到80 μL Tris-buffered saline中，插入試紙條，靜置5 min后觀察結(jié)果。BIO標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與OrfV-HP特異性雜交后形成的復(fù)合物會結(jié)合在有BIO抗體的檢測線上，判讀為陽性；未雜交的OrfV-HP與膠體金標(biāo)記的抗FITC抗體形成不含BIO的復(fù)合物通過檢測線，結(jié)合在質(zhì)控線上，判讀為陰性。

1.6 LAMP-LFD特異性試驗分別以O(shè)rfV-B2L、GTPV、FMDV、PPRV、Mmc的DNA/cDNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，利用AGE及LFD分別檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，以分析該方法的特異性，同時設(shè)立陰性對照。

1.7 LAMP-LFD敏感性試驗將提取的OrfV-B2L質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，以4.95×104～4.95×10-3拷貝/μL為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)AGE和LFD檢測。同時將相同模板利用OrfV-F3/OrfV-B3特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2% AGE檢測。比較LAMP-LFD和PCR方法的敏感性。

1.8 LAMP-LFD重復(fù)性試驗取5個不同時間提取的OrfV-B2L質(zhì)粒DNA稀釋至最低檢測濃度(10-2拷貝/μL)，應(yīng)用LAMP擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AGE及LFD檢測，進(jìn)行批間重復(fù)試驗；取同一時間提取的OrfV-B2L質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋(103～10-2拷貝/μL)，應(yīng)用LAMP擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AGE及LFD檢測，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗。均設(shè)立陰性對照。

1.9 臨床樣品檢測將采集的29份臨床疑似Orf樣品提取DNA，分別進(jìn)行LAMP-LFD和PCR檢測，同時設(shè)立陰、陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 LAMP-LFD反應(yīng)條件的優(yōu)化經(jīng)控制變量法優(yōu)化LAMP-LFD的各反應(yīng)條件。結(jié)果顯示，最終確定LAMP體系為：1.25 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U/μL)，2.5 μL 10×等溫擴(kuò)增緩沖液，3 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)，OrfV-F3/OrfV-B3(20 μmol/L)各0.5 μL，OrfV-FIP/OrfV-BIP(5 μmol/L)各1 μL，2 μL DNA模板，以及11.75 μL ddH2O；LAMP反應(yīng)最佳反應(yīng)溫度為64℃，最佳反應(yīng)時間為30 min(圖2)。LFD檢測探針最適結(jié)合溫度為65℃(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker; NC.陰性對照; 1～6.61，62，63，64，65，66℃; 7～12.10，20，30，40，50，60 min; 13～17. 1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1; 18～23.80，160，240，320，400，480 U/mL; 24～35.0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2，4，6，8，10，12 mmol/L

1～3.63，64，65℃

2.2 LAMP-LFD特異性試驗在同一條件下，分別以O(shè)rfV-B2L、GTPV、FMDV、PPRV、Mmc的DNA/cDNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示，以O(shè)rfV-B2L為模板的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AGE及LFD檢測均為陽性，其他模板及陰性對照均呈陰性(圖4)，表明該方法特異性較強(qiáng)。

M.DL2000 DNA Marker; NC.陰性對照(以蒸餾水為模板);1.OrfV-B2L;2.GTPV;3.FMDV;4.PPRV; 5.Mmc

2.3 LAMP-LFD敏感性試驗對提取的OrfV-B2L質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，以相同模板分別進(jìn)行LAMP及PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，LAMP擴(kuò)增后，AGE和LFD的檢測最低模板濃度為4.95×10-2拷貝/μL；而PCR擴(kuò)增后，檢測的最低模板濃度為4.95×10 拷貝/μL(圖5)。因此，LAMP-LFD的敏度性是利用外引物OrfV-F3/OrfV-B3建立的PCR方法的1 000倍，敏感性較高。

M.DL2000 DNA Marker; NC.陰性對照(以蒸餾水為模板);1～8.pMD18-T-B2L質(zhì)粒稀釋濃度分別為4.95×104～4.95×10-3 拷貝/μL

2.4 LAMP-LFD重復(fù)性試驗批間重復(fù)試驗以不同時間提取的模板稀釋至最低檢測濃度(10-2拷貝/μL)后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)AGE和LFD檢測結(jié)果均為陽性(圖6 A，B)；批內(nèi)重復(fù)試驗以同一時間提取的模板10倍倍比稀釋至最低檢測濃度后，產(chǎn)物經(jīng)AGE和LFD檢測結(jié)果均為陽性(圖6 C，D)。批間試驗及批內(nèi)試驗均顯示LAMP-LFD重復(fù)性及穩(wěn)定性較好。

M.DL2000 DNA Marker;NC.陰性對照(以蒸餾水為模板);1～5.不同時間提取質(zhì)粒DNA的最低檢測濃度作為模板;6～11.同一時間提取質(zhì)粒DNA倍比稀釋后作為模板

2.5 臨床檢測結(jié)果利用本研究建立的LAMP-LFD方法及PCR方法對臨床29份疑似羊口瘡樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，LAMP-LFD檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致，陽性樣本數(shù)均為17份(圖7)。兩種方法檢測符合率達(dá)100%，表明本研究建立的LAMP-LFD方法可應(yīng)用于臨床實踐。

M.DL2000 DNA Marker;1～29.臨床樣本;+.陽性對照;NC.陰性對照(以蒸餾水為模板)

3 討論

近年來，隨著人們生活質(zhì)量的提高，對羊產(chǎn)品的需求增加，促進(jìn)了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。然而，對于羔羊的Orf高發(fā)病率以及繼發(fā)感染，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，需要建立一種快速、簡便、可靠的檢測方法，用于OrfV的檢測。B2L基因是OrfV的第11個開放閱讀框，其編碼的42 kDa蛋白是病毒核衣殼主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。B2L基因高度保守，在不同分離株中序列同源性可達(dá)97%～98%[12]。因此，本研究以O(shè)rfV B2L基因為靶基因，建立高效特異檢測OrfV的LAMP-LFD方法，對該病的診斷及防治具有重要意義。

目前，針對OrfV的檢測方法有PCR、qPCR、ELISA、LAMP及間接免疫熒光(IFA)等[13-16]。對于檢測技術(shù)的實用性和推廣性來說，其靈敏度和特異性、檢測時間以及操作的便捷性是實踐中所追求的重要指標(biāo)。本研究建立的LAMP-LFD檢測方法特異性強(qiáng)，并未擴(kuò)增出其他幾種病原核酸，靈敏度是常規(guī)PCR檢測方法的1 000倍。王海峰[16]基于OrfV VIR基因建立的LAMP方法靈敏度也是常規(guī)PCR法的1 000倍，與本研究結(jié)果一致。LAMP-LFD檢測OrfV時，從核酸擴(kuò)增到結(jié)果判讀只需40 min 即可完成；柴方超等[17]建立的應(yīng)用于遲緩愛德華菌檢測的LAMP-LFD法，檢測時間只需35 min；LIU等[11]建立的檢測沙門菌的LAMP-LFD法，檢測時間在50 min左右；總體來說，LAMP-LFD檢測方法所需時間都較短，比常規(guī)PCR節(jié)約了近2 h，也較qPCR、ELISA等方法快速。該LAMP-LFD技術(shù)不需要特殊儀器設(shè)備和實驗室條件，如PCR儀、熒光顯微鏡等，只需恒溫水浴即可完成，相對于其他幾種檢測方法具有明顯優(yōu)勢。

LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳、目視比濁、鈣黃綠素測定、目視熒光檢測以及LFD等方法來判定。瓊脂糖凝膠電泳法檢測時需要接觸溴化乙錠等有毒試劑，且容易產(chǎn)生氣溶膠污染導(dǎo)致假陽性。由于LAMP引物多，產(chǎn)物復(fù)雜，如核酸模板含量低時，比濁等方法存在主觀上的弊端。另外目視熒光檢測判定方法中使用的一些染料如SYBR Green可與擴(kuò)增產(chǎn)物核酸結(jié)合，影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量[17]。同時上述幾種方法均不能區(qū)分特異性擴(kuò)增和非特異性擴(kuò)增。LFD檢測方法對LAMP結(jié)果的判定是基于序列間特異性雜交，利用FITC標(biāo)記探針與BIO標(biāo)記LAMP產(chǎn)物特異性結(jié)合，短時間內(nèi)得到直觀且客觀的試驗結(jié)果，在保證檢測靈敏度的同時避免了其他方法的弊端。

綜上，本研究根據(jù)OrfV的B2L基因建立的LAMP-LFD技術(shù)，能夠特異性的檢測OrfV，檢測時間只需40 min，且該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，臨床樣本檢出與常規(guī)PCR符合率為100%，不需要特殊儀器設(shè)備和實驗室條件，可作為一種新型檢測方法應(yīng)用于現(xiàn)場及基層檢測。