呂 靜，劉文波，劉 暢，任同偉，陳 櫻，歐陽(yáng)康，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

(廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530005)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性傳染病，俗稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”。該病可導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎、返情等繁殖系統(tǒng)障礙、仔豬高死亡率、各年齡段豬只不同程度的呼吸道癥狀及食欲減退、并能引起免疫抑制和持續(xù)感染[1-3]，給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)于1995年開(kāi)始暴發(fā)此病，郭寶清等[4]首次從流產(chǎn)胎兒中分離到美洲型PRRSV，并命名為CH-1a。2006年我國(guó)多地暴發(fā)高致病性PRRS，由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起，感染了超過(guò)200萬(wàn)頭豬，死亡病例約40萬(wàn)頭，發(fā)病率和死亡率較經(jīng)典型PRRS均明顯升高[5-6]。2013年起，與NADC30毒株高度同源的毒株不斷被分離并報(bào)道，其nsp2區(qū)域存在不連續(xù)缺失了131個(gè)氨基酸[7]，統(tǒng)稱(chēng)這類(lèi)毒株為NADC30-like毒株。我國(guó)現(xiàn)在流行的毒株主要為美洲型，其中主要優(yōu)勢(shì)流行毒株為譜系8毒株(HP-PRRSV-like)、譜系1毒株(NADC30-like)和譜系3毒株(QYYZ-like)。

PRRSV不論在體內(nèi)還是體外均表現(xiàn)出嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性。在體內(nèi)，PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)；在體外，PRRSV只在原代PAMs和MA104以及衍生細(xì)胞系MARC-145中繁殖[8]。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV通過(guò)結(jié)合細(xì)胞受體進(jìn)入易感細(xì)胞，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞受體主要有：唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)、硫酸乙酰肝素(heparin sulphate,HS)、波形蛋白(vimentin)、CD163分子、CD151分子及非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA分子[9]。CD163分子是大小約130 kDa的糖蛋白，富含半胱氨酸，其主要介導(dǎo)PRRSV在細(xì)胞質(zhì)中的脫衣殼和病毒基因組的釋放[10-11]，并且已經(jīng)確定CD163分子的病毒結(jié)合區(qū)為清道夫受體半胖氨酸富含結(jié)構(gòu)域(SRCR)5-9[12]?，F(xiàn)已成功建立的穩(wěn)定表達(dá)pCD163的細(xì)胞系有：HEK-293-pCD163細(xì)胞系[13]、PAM-CD163細(xì)胞系[9]、CHO-K1-CD163細(xì)胞[14]、MARC-145-CD163細(xì)胞系[15]、PK-15-CD163細(xì)胞系[16]、BHK-21-CD163細(xì)胞系[17]等。已有報(bào)道通過(guò)普通單質(zhì)粒載體方法構(gòu)建出MARC-145-CD163細(xì)胞系。本研究通過(guò)慢病毒病毒載體的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pCD163受體的MARC-145細(xì)胞系，該方法宿主細(xì)胞廣泛，轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高,該細(xì)胞系可用于高效、快速地增殖PRRSV毒株，為PRRSV的分離和相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry購(gòu)自生物風(fēng)生物科技有限公司；VSVG質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒、MARC-145細(xì)胞、293T細(xì)胞、PAMs細(xì)胞、PRRSV毒株(GXNN1396、GXNN202004a、GXGG202007)均由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ購(gòu)自NEB公司；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、TaKaRa LA Taq?、dNTP Mixture、T4DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程有限公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit、HP Total RNA Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Lipofectamine 2000、fluorescein goat anti-mouse IgG(H+L)購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)基MEM、新生胎牛血清(FBS)、DMEM粉劑、0.05%Trypsin-EDTA、0.25%Trypsin-EDTA購(gòu)自Gibco公司；Mouse anti-porcine CD163購(gòu)自Bio-Rad公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL Western blot Kit購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的pCD163基因序列(登錄號(hào)：HM991330)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增pCD163受體基因序列的特異性引物，并在引物的上、下游分別引入酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamHⅠ。引物序列如下：pCD163-F:5′-CGATCTAGAATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3′,pCD163-R：5′-CGAGGATTCT-CATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG-3′，下劃線(xiàn)為內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 總RNA的提取及pCD163基因的擴(kuò)增使用HP Total RNA Kit試劑盒提取PAMs總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10× LA Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，pCD163-F 2 μL，pCD163-R 2 μL，TaKaRa LA Taq 1 μL，ddH2O 35 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，63℃退火45 s，72℃延伸3 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后切膠純化回收。

1.5 重組質(zhì)粒pLVX- pCD163-IRES-mCherry的構(gòu)建及鑒定pCD163膠回收產(chǎn)物及慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-mCherry分別使用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后純化回收，經(jīng)T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LA平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單個(gè)菌落于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，次日抽提質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定后，將陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pLVX-pCD163-IRES-mCherry。

1.6 重組質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞將293T細(xì)胞傳代于6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)，將重組質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry:psPAX2∶VSVG=5 μg∶3.5 μg∶1.25 μg 的比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h觀(guān)察細(xì)胞及熒光表達(dá)情況，收集上清慢病毒感染液后添加2 mL新鮮10% FBS DMEM培養(yǎng)基；72 h再次收取細(xì)胞上清液，3 000×g離心10 min，-80℃保存。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞篩選將MRAC-145細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用48 h慢病毒感染液感染MARC-145細(xì)胞，37℃孵育4～6 h，間隔1 h搖板1次，棄去感染液，加入新鮮的2% FBS DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置未感染的MARC-145細(xì)胞為陰性對(duì)照。感染96 h后，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，嘌呤霉素質(zhì)量濃度為16 mg/L。每天觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)，3 d左右更換1次含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，待陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡后，終止篩選。將藥物篩選后存活的細(xì)胞消化為單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用終點(diǎn)稀釋法稀釋細(xì)胞，接種于96孔板，使每個(gè)孔細(xì)胞數(shù)為0～1個(gè)，培養(yǎng)10～14 d。待96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，選取具有紅色熒光的單克隆細(xì)胞株移至12孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后對(duì)孔中部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.8 RT-PCR檢測(cè)MARC-pCD163細(xì)胞系中CD163表達(dá)使用0.25%胰酶消化篩選到的MARC-pCD163細(xì)胞系，取部分細(xì)胞裂解，其余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。裂解后的細(xì)胞使用HP Total RNA Kit試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，同時(shí)設(shè)置MARC-145細(xì)胞為陰性對(duì)照。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴(kuò)增CD163受體序列，PCR反應(yīng)體系及條件按照1.4方法進(jìn)行。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察分析結(jié)果。

1.9 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)MARC-pCD163細(xì)胞系中pCD163表達(dá)將RT-PCR鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞株繼續(xù)傳代至12代接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞密度達(dá)100%時(shí)，PBS洗滌3次，冰甲醇4℃固定30 min；加入1% BSA常溫封閉30 min，PBS洗滌3次；加入1∶300倍稀釋后的小鼠抗pCD163單克隆抗體，37℃孵育2 h后，PBS洗滌5次，每次5 min；加入1∶500稀釋的Alexa Fluor 568標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗滌5次，每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。設(shè)置MARC-145細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.10 Western blot檢測(cè)MARC-pCD163細(xì)胞系中CD163表達(dá)情況分別將MARC-pCD163細(xì)胞及MARC-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入配置好的RAPI裂解液(RAPI∶PMSF=100∶1)于冰上裂解20 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液加入5×loading buffer，于沸水中煮10 min。樣品經(jīng)12% SDS-PAGE后，按照Bio-Rad公司半干轉(zhuǎn)儀操作說(shuō)明進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中常溫封閉2 h，加入1∶300稀釋的小鼠抗pCD163單克隆抗體，4℃過(guò)夜孵育；TBST洗膜5次，每次5 min；加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜5次,用ECL Western blot Kit試劑盒顯色后觀(guān)察結(jié)果。

1.11 MARC-pCD163細(xì)胞對(duì)不同PRRSV毒株增殖能力的測(cè)定將MARC-pCD163細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞同時(shí)感染0.1 MOI的不同譜系PRRSV毒株GXNN1396(lineage 8)、GXNN202004a (lineage 1)、GXGG202007 (lineage 3)，分別于感染后24，48，72，96，120 h收取300 μL細(xì)胞上清。將收獲的病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?0-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-77個(gè)稀釋梯度，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置未接毒組作為對(duì)照，每天觀(guān)察細(xì)胞病變(CPE)情況，按照Reed-Muench法計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)待測(cè)病毒TCID50值，繪制病毒增殖曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry的構(gòu)建和包裝以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板PCR擴(kuò)增獲得pCD163基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)約3 348 bp的目的條帶(圖1A)。將pCD163基因克隆至pLVX-IRES-mCherry中，重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切得到預(yù)期大小的片段(圖1B)，測(cè)序結(jié)果表明pLVX-pCD163-IRES-mCherry質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pLVX-pCD163-IRES- mCherry與包裝輔助質(zhì)粒psPAX2、VSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48，72 h均可觀(guān)察到紅色熒光，表明慢病毒包裝成功。

A.pCD163基因PCR擴(kuò)增片段(M.DL5000 DNA Marker；1.pCD163基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)；B.重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(M.DL10000 DNA Marker；1,2.pLVX-pCD163-IRES-mCherry質(zhì)粒XbaⅠ/BamHⅠ酶切產(chǎn)物)

2.2 細(xì)胞系的篩選與鑒定慢病毒感染MARC-145細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選，存活細(xì)胞經(jīng)終點(diǎn)稀釋法接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10～14 d可見(jiàn)明顯細(xì)胞克隆團(tuán)。將顯微鏡下觀(guān)察有紅色熒光的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增pCD163基因，可見(jiàn)在3 348 bp處有相符目的條帶(圖2)。將RT-PCR鑒定正確的細(xì)胞傳至12代，IFA可以觀(guān)察到MARC-pCD163細(xì)胞呈特異性的綠色熒光，而MARC-145細(xì)胞無(wú)綠色熒光(圖3)。收取細(xì)胞總蛋白，Western blot試驗(yàn)檢測(cè)到MARC- pCD163細(xì)胞在130 kDa左右處有目的條帶，而MARC-145細(xì)胞未檢測(cè)到條帶(圖4)。上述結(jié)果表明成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)豬CD163受體蛋白的MARC-145細(xì)胞系。

M.DL5000 DNA Marker；1～6.細(xì)胞系的RT-PCR產(chǎn)物；7.MARC-145細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物；8.陰性對(duì)照

A..MARC-pCD163細(xì)胞；B.MARC-145細(xì)胞

1.MARC-pCD163細(xì)胞系；2.MARC-145細(xì)胞

2.3 MARC-pCD163細(xì)胞對(duì)不同PRRSV毒株增殖能力的測(cè)定將MARC-pCD163細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞同時(shí)感染0.1 MOI的3個(gè)不同譜系的PRRSV毒株，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50，繪制3株毒株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。3株毒株在MARC-pCD163細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞上最高滴度相近，但在MARC-145細(xì)胞上最高滴度出現(xiàn)的時(shí)間為96 h，MARC-pCD163細(xì)胞上最高滴度出現(xiàn)的時(shí)間為48 h，結(jié)果表明MARC-pCD163細(xì)胞能顯著加快病毒最高滴度出現(xiàn)的時(shí)間。

圖5 PRRSV在MARC-pCD163和MARC-145細(xì)胞中的增殖圖

3 討論

pCD163分子已被鑒定為兩種基因型PRRSV的細(xì)胞受體[18]。GORP等[19]用Sn和pCD163抗體同時(shí)孵育PAM細(xì)胞，能阻斷PRRSV感染PAM細(xì)胞，但單獨(dú)的pCD163抗體不能阻斷PRRSV感染細(xì)胞，表明Sn與pCD163具有協(xié)同作用，但pCD163分子不介導(dǎo)PRRSV內(nèi)化。DELRUE等[20]研究表明單獨(dú)表達(dá)Sn的細(xì)胞能夠吸附并內(nèi)吞PRRSV，但PRRSV不能脫衣殼，但同時(shí)表達(dá)Sn和pCD163分子的細(xì)胞則能產(chǎn)生子代PRRSV，表明pCD163分子參與病毒的脫衣殼過(guò)程。流式細(xì)胞試驗(yàn)表明，PRRSV感染性與pCD163表達(dá)量之間存在直接正向關(guān)系[21]，且試驗(yàn)證明PRRSV非敏感細(xì)胞(BHK-21、LLC-PK1、PK-15等)中過(guò)表達(dá)pCD163，能使非敏感細(xì)胞被PRRSV感染并能產(chǎn)生高滴度的子代病毒[8]。目前，常用MA104以及衍生細(xì)胞系MARC-145進(jìn)行PRRSV毒株分離。然而，有些PRRSV毒株，特別是近年流行的NADC30-like毒株，在傳代細(xì)胞系中復(fù)制能力弱，產(chǎn)生滴度低，難以獲得在細(xì)胞系中穩(wěn)定傳代的病毒。而這些毒株在PAM中有較好的復(fù)制能力。為此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增pCD163基因序列，從PAM細(xì)胞中經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到pCD163基因，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)pCD163的MARC-145細(xì)胞系。盡管不同譜系的PRRSV毒株在MARC-pCD163和MARC-145均能產(chǎn)生同樣高的病毒量，但PRRSV毒株在MARC-pCD163細(xì)胞中最高病毒滴度出現(xiàn)的時(shí)間早于48 h，為以后PRRSV毒株的分離培養(yǎng)和受體功能奠定了基礎(chǔ)。

目前，構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的載體主要有普通單質(zhì)粒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體等[9]。慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，對(duì)處于分裂期和非分裂期的細(xì)胞均具有感染能力，能夠感染多種類(lèi)型的細(xì)胞，且能攜帶大片段的外源基因在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下高效地整合至目的細(xì)胞染色體中[22]。目前所應(yīng)用的慢病毒屬于復(fù)制缺陷型病毒，具有良好的生物安全性，是一種理想的用于建立穩(wěn)定細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)移載體。常用的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)為第1代的3質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)和第2、3代的4質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，其中第2、3代的4質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)生物安全性更好。293T細(xì)胞是由293細(xì)胞通過(guò)基因技術(shù)衍生出的細(xì)胞系，具有生長(zhǎng)速度快、易轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病毒包裝，但293T細(xì)胞貼壁性不強(qiáng)，在培養(yǎng)293T細(xì)胞及使用293T包裝慢病毒時(shí)需要特別注意。本試驗(yàn)選用慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry，載體本身帶有嘌呤霉素抗性基因和紅色熒光蛋白標(biāo)記基因，可以通過(guò)在熒光顯微鏡下觀(guān)察紅色熒光，從而更加直觀(guān)地觀(guān)察監(jiān)測(cè)慢病毒包裝、慢病毒感染目的細(xì)胞及使用嘌呤霉素篩選細(xì)胞的情況。本試驗(yàn)通過(guò)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬pCD163受體蛋白的MARC-145細(xì)胞系，PRRSV在MARC-pCD163細(xì)胞中的增殖速度及病毒滴度均有所提高，為今后的PRRSV分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性及PRRSV細(xì)胞受體的研究奠定基礎(chǔ)。