楊賽霞，趙亞茹，劉志杰，楊吉飛，張忠輝，樊 潔，耿抒賢，呂欣倩，敬夢瑤，殷 宏，2，牛慶麗*

(1.國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?蘭州)/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

非洲豬瘟 (African swine fever,ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus,ASFV) 感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病毒感染后致死率高達100%，目前尚無有效的疫苗和治療藥物。ASFV感染家豬和野豬，軟蜱科中的鈍緣蜱屬(Ornithodoros)是ASF的儲藏宿主和傳播媒介[1]。該病引起的臨床癥狀主要包括高熱、發(fā)紺、厭食癥和共濟失調(diào)，甚至死亡。在急性和亞急性的ASF感染中，不同器官均表現(xiàn)出嚴(yán)重的出血，如腎瘀點和淋巴結(jié)的彌漫性出血、血管內(nèi)凝血、肺水腫和血小板減少等[2]。ASF在我國首次暴發(fā)于2018年8月[3]，截至2021年1月，已在31個省、市、自治區(qū)發(fā)生和流行，給我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重損失[4]。世界動物衛(wèi)生組織 (World Organization for Animal Health,OIE)將ASF列為必須通報動物疫病，我國將其列為重點防范的一類動物傳染病。

AFSV是一種大的有囊膜的病毒，呈二十面體對稱，平均直徑約為200 nm，與環(huán)烯病毒、痘病毒具有相似的基因組和結(jié)構(gòu)特征，均屬于大的核質(zhì)類DNA病毒(nucleoplasmic large DNA virus,NCLDV)[5]。病毒基因組為末端共價閉合的雙鏈DNA，大小在170 ～190 kb之間，編碼151～167個開放閱讀框[6]。ASFV主要感染豬單核巨噬細胞，并在細胞中增殖；根據(jù)編碼主要衣殼蛋白p72的基因(B646L)C端序列變異的遺傳特征，ASFV可分為24種基因型[7]，序列比對分析發(fā)現(xiàn)，我國流行的毒株與俄羅斯和中東歐國家流行的毒株均屬于基因Ⅱ型[8]。

真核生物的轉(zhuǎn)錄有3種聚合酶(RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和3種不同的啟動子以及相關(guān)元件。RNA聚合酶Ⅱ由8～14個亞基組成，其自身不能單獨啟動轉(zhuǎn)錄，通用轉(zhuǎn)錄因子(TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH)通過聚合酶Ⅱ組裝在啟動子DNA上，和定位因子TATA結(jié)合蛋白 (TATA binding protein TBP，TFIID的一個亞基) TBP共同形成精確起始轉(zhuǎn)錄的大型多蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物[9]。

NCLDV具有相當(dāng)復(fù)雜的RNA聚合酶。研究表明，與真核生物RNA聚合酶Ⅱ編碼的14個亞基相比，ASFV編碼了同源于真核RNA聚合酶Ⅱ亞基的RPB1(Pol Ⅱ的亞基)、2、3、5、6、7、10、TFIIB和TFIIS共9個亞基[10]，有研究推測NCLDV在復(fù)制循環(huán)過程中，RNA聚合酶亞基基因存在缺失，因此可能會利用宿主RNA聚合酶亞基和通用轉(zhuǎn)錄因子，以提高它們在宿主細胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄效率[11]。TFIIB是構(gòu)成RNA聚合酶Ⅱ啟動復(fù)合物的幾種通用轉(zhuǎn)錄因子之一。在真核生物細胞中，RPB3是RNA聚合酶Ⅱ的核心亞基，與RPB11亞基一起形成異二聚體，被認為是啟動子識別中涉及的細菌α亞基同型二聚體的功能對偶物。RPB1、RPB2、RPB3和RPB11主要負責(zé)Pol Ⅱ的RNA催化[12]。研究表明，ASFV H359L基因與真核生物RPB3具有高度的相似性[10]，因此，pH359L蛋白可能具有與ASFV轉(zhuǎn)錄相關(guān)的生物學(xué)功能。

目前國內(nèi)外對ASFV pH359L蛋白在ASFV基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中的功能尚未見報道。因此，本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達ASFV pH359L蛋白，在其基礎(chǔ)上制備多克隆抗體，為研究ASFV pH359L蛋白的功能和探索ASFV轉(zhuǎn)錄機制提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞、載體和實驗動物豬肺泡巨噬細胞(PAMs)、SPF豬血清和ASFV陽性血清、基因組及ASFV(CN/GS/2018)毒株均由國家ASF區(qū)域?qū)嶒炇?蘭州)保存，并在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生物安全三級實驗室中在PAMs中擴增。Trans 5α感受態(tài)細胞、BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；原核表達載體 pET-28a(+)由本試驗保存；健康豬購自康樂縣磊鑫生豬養(yǎng)殖有限責(zé)任公司；2月齡SPF級雄性新西蘭大白兔購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物實驗中心。

1.2 主要試劑Q5 Hot start High-Fidelity 2× Master Mix、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、EcoRⅠ和T4DNA連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；IPTG購自生工生物工程(上海)股份有限公司；鎳預(yù)裝柱購自金斯瑞生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標(biāo)記的山羊抗兔及抗豬二抗均購自Sigma公司；預(yù)染蛋白Marker、超敏化學(xué)發(fā)光顯色液及RIPA裂解液購自Thermo Fisher Scientific有限公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。

1.3 H359L基因擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄的ASFV HLJ/18 (MK_333180) 毒株H359L基因序列(Gene ID:QBH90556)設(shè)計特異性引物：H359L-F:5′-CGCCATATGGAAAAAAT-TTTCCAAAACGTGGAAATCAAAC-3′,H359L-R:5′-CCGGAATTCTTAAGCAATCAGTTCATCAACATTTTTTTCAAGAATTTG-3′，在上、下游引物的5′端分別加入EcoRⅠ和NdeⅠ酶切位點(下劃線)。采用PCR方法對H359L基因進行擴增，反應(yīng)體系為(50 μL)：Q5 Hot start High-Fidelity 2×Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL，ASFV基因組2 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物的大小，用膠回收試劑盒純化回收。用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ分別酶切目的基因片段和pET-28a(+)表達載體，用膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接目的基因和表達載體，并轉(zhuǎn)化至E.coliTrans5α感受態(tài)細胞，涂布LB平板(卡那青霉素抗性)，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，鑒定正確的單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將酶切和測序均正確的單克隆經(jīng)菌液培養(yǎng)后提取質(zhì)粒(pET-28a-H359L)于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pH359L重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化將重組表達質(zhì)粒pET-28a-H359L轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，挑取單克隆接種于3 mL LB(卡那青霉素抗性)液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取1 mL過夜表達的菌液接種到1 L LB培養(yǎng)基，37℃，200 r/min 擴大培養(yǎng)至D600 nm到0.6～0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達6 h；12 000 r/min 離心15 min，收集菌體沉淀進行超聲破碎，4℃，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白表達形式。鎳柱層析法純化目的蛋白，純化完成后分別用6，4，2，0 mol/L尿素透析，透析時間分別為4，6，8，2 h；重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測及濃度測定后分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組蛋白的反應(yīng)性鑒定純化后的pH359L重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入5%脫脂乳室溫封閉1 h；分別將ASF陽性血清和陰性血清1∶500稀釋后4℃孵育，過夜，TBST洗膜5次，每次5 min；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的山羊抗豬IgG 1∶5 000稀釋后室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min；利用ChemiDoc XRS(BIO-RAD)凝膠成像系統(tǒng)分析重組蛋白與ASF陰、陽性血清的反應(yīng)性。

1.6 兔抗pH359L蛋白多克隆抗體的制備將純化的pH359L重組蛋白(300 μg/只)與相同劑量的弗式完全佐劑乳化后，采用背部皮下多點注射的方法首次免疫新西蘭大白兔，每間隔2周用150 μg蛋白和等體積弗式不完全佐劑乳化加強免疫；三免后，通過耳緣靜脈采血并收集血清，于-20℃分裝保存。

1.7 多克隆抗體效價的測定采用間接ELISA方法測定制備的抗ASFV pH359L蛋白多克隆抗體的效價。采用0.4 μg/孔pH359L蛋白包被ELISA反應(yīng)板，4℃過夜；PBST洗滌3次，用2% BSA，37℃封閉1 h；PBST洗滌3次，將血清以1∶1 000～ 1∶512 000倍比稀釋，100 μL/孔，加入到反應(yīng)板中，于37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，100 μL/孔加入1∶5 000 稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，每孔加入100 μL TMB，37℃避光顯色5 min，每孔加入100 μL H2SO4(2 mol/L)終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測定D450 nm值，根據(jù)P/N≥2.1計算抗體效價。

1.8 多克隆抗體的Western blot檢測ASFV(MOI=0.2)感染PAM后48 h，同時用未感染ASFV的PAM作為對照組，分別收集感染和未感染的細胞樣品，于4℃,1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌1次。用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細胞沉淀30 min，4℃，12 000×g/min離心30 min，取上清進行蛋白濃度測定，加入2×Loading buffer 100℃煮沸10 min。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，制備的多克隆抗體1∶200稀釋后加入PVDF膜4℃孵育過夜；洗膜后加入1∶5 000 稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h；利用ChemiDoc XRS(BIO-RA)凝膠成像系統(tǒng)分析制備的抗體與ASFV天然蛋白的反應(yīng)性。

1.9 間接免疫熒光試驗(IFA)ASFV(MOI=100)感染PAM 24 h后棄上清，PBS洗2次，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗5次，每次10 min；用0.3% TrionX-100透膜15 min，PBS洗5次，每次10 min；用5% BSA封閉2 h后，加入以5% BSA稀釋的兔抗pH359L(1∶50)多克隆抗體，于4℃孵育過夜，PBS洗5次，每次10 min；FITC標(biāo)記的山羊抗兔的二抗1∶200稀釋后室溫避光孵育1 h，PBS洗5次，每次10 min；1 mg/L的 DAPI染色1 min，PBS洗5次；加入少量PBS，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 H359L基因擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測到與預(yù)測大小一致的單一條帶(圖1A)。將目的基因連接到pET-28a載體后，對構(gòu)建的pET-28a-H359L重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，結(jié)果獲得1 089 bp和pET-28a載體片段2條帶(圖1B)。挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank 登錄的H359L基因序列相似性為100%，無點突變，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。

M.DL5000 DNA Marker；1.H359L基因 PCR 產(chǎn)物；2.NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切pET-28a-H359L 質(zhì)粒產(chǎn)物

2.2 pH359L重組蛋白的原核表達與純化將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞后，加入終濃度為0.1 mmol的IPTG誘導(dǎo)表達6 h，收集菌體超聲裂解進行可溶性分析。SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)表達的pH359L重組蛋白以包涵體形式表達(圖2A)，經(jīng)Ni柱純化后的pH359L蛋白大小為43.0 kDa，獲得與預(yù)期大小一致、單一的蛋白條帶(圖2B)，表明得到純度較好的pH359L蛋白。

M.蛋白 Marker；1.pH359L誘導(dǎo)表達上清；2.pH359L誘導(dǎo)表達沉淀；3.pH359L純化蛋白

2.3 重組蛋白反應(yīng)原性鑒定將純化后的重組蛋白SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜進行蛋白反應(yīng)原性分析。Western blot檢測結(jié)果表明，pH359L蛋白可以與ASFV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，與陰性血清不發(fā)生反應(yīng)(圖3)。

M.蛋白 Marker；1.陽性血清；2.陰性血清

2.4 多克隆抗體的制備及抗體效價測定將純化的pH359L蛋白用弗氏佐劑乳化后免疫新西蘭大白兔，三免后收集血清，應(yīng)用間接ELISA方法進行抗體效價測定。結(jié)果表明，抗pH359L蛋白多克隆抗體的抗體效價達到1∶512 000(圖4)，產(chǎn)生了較好的免疫反應(yīng)。

圖4 兔抗pH359L多克隆抗體效價測定

2.5 多克隆抗體反應(yīng)性鑒定利用ASFV感染PAM后制備的病毒抗原進行多克隆抗體的特異性鑒定。將本研究制備的pH359L多克隆抗體1∶200稀釋后作為一抗進行Western blot分析，結(jié)果顯示，抗pH359L蛋白的多克隆抗體能夠與ASFV天然抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，表明制備的多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性(圖5)。

M.蛋白 Marker；1.ASFV未感染組；2.ASFV感染組

2.6 IFA驗證ASFV毒株CN/GS/2018感染PAM 24 h后，用4%多聚甲醛固定，利用抗pH359L(1∶50)多克隆抗體進行免疫熒光分析。結(jié)果表明，抗pH359L多克隆抗體可識別ASFV感染PAM表達的天然蛋白pH359L(圖6)。

圖6 兔抗pH359L蛋白多克隆抗體對天然ASFV H359L蛋白識別的檢測

3 討論

自1921年ASF首次報道后，主要流行于撒哈拉以南非洲地區(qū)。2007年格魯吉亞暴發(fā) ASF，隨后疫情迅速蔓延至亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯。2014年ASF傳入東歐大部分國家并逐步呈現(xiàn)出擴大流行的趨勢[13]。2018年ASF于我國遼寧沈陽首次暴發(fā)[3]，逐漸擴散到全國，對我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失和前所未有的打擊。ASFV主要感染單核、巨噬細胞等免疫細胞，感染后導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫損傷和免疫抑制[14]。目前尚無有效商品疫苗，急需闡明其感染、致病和免疫機制。但由于ASFV編碼眾多蛋白，且大多數(shù)蛋白功能未知，嚴(yán)重阻礙了對其致病機制研究的步伐。

ASFV與痘病毒類似，屬于核質(zhì)大DNA病毒(NCLDV)[10]。在ASFV感染細胞的過程中，病毒DNA復(fù)制起始于細胞核，存在短暫的入核過程，隨后部分病毒基因復(fù)制和病毒組裝發(fā)生在細胞質(zhì)中。然而病毒DNA復(fù)制核內(nèi)階段的作用及其機制并不清楚；另外，復(fù)制的中間體也在ASFV感染細胞的細胞核和胞質(zhì)中合成[15]。以上結(jié)果表明細胞核可能提供了小規(guī)模的轉(zhuǎn)錄模式。20%的ASFV基因組用于編碼與其mRNA的轉(zhuǎn)錄和修飾有關(guān)的20多種基因[10]。

ASFV通過調(diào)控宿主基因的轉(zhuǎn)錄，以滿足病毒生存和增殖[16]。目前，已報道A238L、A224L、D250R等病毒基因可調(diào)控宿主基因轉(zhuǎn)錄。A238L基因是IκB的同源基因，是NF-κB通路的抑制因子，它的表達能阻止NF-κB通路的激活[17]，進而阻止被感染細胞的炎性因子、Ⅰ型干擾素、腫瘤壞死因子及IL-8等多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄[18]。A238L蛋白還能和PP3C(protein phosphatase 3C)的催化位點結(jié)合，影響PP3C的活性并抑制NFAT(nuclear factor of activated T-cells)轉(zhuǎn)錄因子的激活，進而調(diào)控多種細胞因子如IL-2、GM-CSF、IL-3和IFN-γ基因的表達[19]。A224L能降解Myc/Max/Mad通路中的Mad蛋白[20]，Myc/Max/Mad通路對細胞的生長、分化和凋亡具有重要的調(diào)控意義。在該通路中，Myc與 Max蛋白形成二聚體并與特定的DNA序列結(jié)合從而影響特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達，Mad與 Max結(jié)合后則會抑制Myc與Max形成二聚體。A224L可通過降解Mad蛋白從而激活細胞內(nèi)與生長、翻譯相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄[16]。D250R與宿主細胞的脫帽酶2 (decapping enzyme 2 Dcp2)具有共同的Nudix基序[21]，研究表明D250R在體外能對mRNA進行脫帽，在ASFV感染過程中具有對宿主細胞和病毒mRNA降解的功能。

由于ASFV pH359L與真核生物中主要負責(zé)聚合酶Ⅱ催化的核心亞基RPB3比較相似，因此蛋白pH359L在病毒轉(zhuǎn)錄過程中可能發(fā)揮重要作用[10]。本研究構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-28a-H359L，IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)可溶性分析表明pH359L蛋白以包涵體形式表達，鎳柱親和層析純化出純度較高蛋白。經(jīng)Western blot驗證，pH359L重組蛋白能夠和ASF陽性血清發(fā)生反應(yīng)，為ASFV血清學(xué)診斷方法提供了依據(jù)。將純化的蛋白免疫新西蘭大白兔制備抗pH359L蛋白的多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA方法測定本研究制備的多抗效價達到1∶512 000以上，Western blot和IFA檢測結(jié)果表明制備的抗pH359L多克隆抗體能夠特異性識別ASFV感染PAMs后編碼的pH359L蛋白，表明多克隆抗體具有很好的反應(yīng)性和特異性。本試驗純化的pH359L蛋白及其免疫兔制備多克隆抗體，為實驗室后續(xù)研究蛋白的功能及ASFV轉(zhuǎn)錄相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。