范香媛，張金成，胡永紅*

(1.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.石家莊郵電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050021)

蜱是專性吸血體外寄生蟲，是僅次于蚊子的世界第二大傳播疾病媒介，可以將多種病原體(細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物等)傳播給宿主，但因其存在先天性免疫，在受到病原體感染后不影響自身的生存和發(fā)育[1-2]。蜱的先天免疫是受到病原體侵染后激活的，盡管蜱-病原體之間已共存進(jìn)化了3億多年，但很少有微生物能克服蜱的先天性免疫系統(tǒng)[3-4]。

與同時(shí)具備先天性免疫和獲得性免疫的脊椎動(dòng)物不同，由于缺乏淋巴細(xì)胞、胸腺和抗體，蜱只具備先天免疫[5]。蜱的先天免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫，兩者協(xié)同作用。細(xì)胞免疫包括吞噬、結(jié)節(jié)化或包裹入侵微生物的作用，由含硫酯蛋白質(zhì)(thioester-containing proteins,TEPs)、纖維蛋白原相關(guān)凝集素和轉(zhuǎn)化酶因子組成的原始補(bǔ)體系統(tǒng)所調(diào)節(jié)[6]；體液免疫主要包括抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，例如防御素和溶菌酶，這些肽直接殺死、誘捕或抑制入侵者。此外，蜱還表達(dá)凝集素、蛋白酶抑制劑以及氧化應(yīng)激蛋白，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)來(lái)殺死或抑制微生物[7]。因此，了解蜱的先天免疫，掌握蜱-病原體之間的免疫學(xué)，以期為篩選新的抗蜱疫苗靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 蜱中腸免疫

中腸免疫對(duì)蜱作為傳播媒介的能力有決定性影響，其腸道內(nèi)容物會(huì)對(duì)入侵的微生物產(chǎn)生不利影響，主要原因?yàn)橹心c內(nèi)存在的宿主血紅蛋白片段以及AMPs具有抗菌活性，能夠防御革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌和一些真菌[8]。具有抗菌活性的血紅蛋白片段最早從微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus) 中腸分離，后在其他軟蜱、硬蜱物種中腸內(nèi)也鑒定到[9-10]。例如，墨巴鈍緣蜱(Ornithodorosmoubata) 中腸腔內(nèi)的兔血紅蛋白片段，具有抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 活性[11]。

產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes) 侵染墨巴鈍緣蜱時(shí)，蜱中腸至少分泌2種抗菌化合物來(lái)保護(hù)自身，包括防御素和溶菌酶[12]。塞氏鈍緣蜱(Ornithodorossavignyi) 中腸內(nèi)存在一種22個(gè)氨基酸組成的防御素，其能殺滅革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌[13]。據(jù)報(bào)道，一種名為longicin的防御素分子在長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalislongicornis) 中腸表達(dá)，其對(duì)多種微生物具有抗菌活性，包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌和各種巴貝斯蟲[14]。TGL (tick gut lysozyme)是從墨巴鈍緣蜱中腸分離出的第一個(gè)溶菌酶，其可水解革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的1，4-β-糖苷鍵，具有殺菌作用[15]。

此外，當(dāng)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體(Anaplasmaphagocytophilum) 入侵微小扇頭蜱時(shí)，蜱體內(nèi)GST和SOD基因表達(dá)上調(diào)，沉默該基因有利于嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的生存和繁殖，表明GST和SOD可影響嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體對(duì)蜱的侵染[16]。牛巴貝斯蟲(Bovinebabesiosis) 體外培養(yǎng)試驗(yàn)證明，培養(yǎng)基中半胱氨酸蛋白酶抑制劑濃度越高，牛巴貝斯蟲的生長(zhǎng)越緩慢，表明微小扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制劑能抑制牛巴貝斯蟲的生長(zhǎng)[17]。

2 蜱血淋巴免疫

2.1 細(xì)胞免疫

2.1.1蜱血細(xì)胞 病原體從蜱中腸到外周組織過(guò)程中，面臨著細(xì)胞和體液免疫的雙重防御屏障。蜱類血淋巴內(nèi)的先天性免疫主要與細(xì)胞和體液免疫有關(guān)。根據(jù)不同蜱種血淋巴細(xì)胞的形態(tài)和生理研究，鑒定描述了4種基本類型的蜱血細(xì)胞，即原血細(xì)胞，漿細(xì)胞，粒細(xì)胞和小球細(xì)胞，其中粒細(xì)胞又分為粒細(xì)胞Ⅰ和粒細(xì)胞Ⅱ[18]。免疫組化電鏡結(jié)果顯示，漿細(xì)胞和粒細(xì)胞Ⅰ中有溶酶體，表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶菌活性[19]。將伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)注射進(jìn)變異革蜱(Dermacentorvariabili) 雌蜱體腔，24 h后免疫熒光檢測(cè)血淋巴、唾液腺和卵巢，均未發(fā)現(xiàn)伯氏疏螺旋體，推測(cè)其被血細(xì)胞吞噬清除[20]。將產(chǎn)吲哚金黃桿菌感染篦子硬蜱(Ixodesricinus) 和墨巴鈍緣蜱，熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2種蜱的血細(xì)胞對(duì)產(chǎn)吲哚金黃桿菌均有明顯吞噬作用[21]。相比之下，蜱血細(xì)胞對(duì)革蘭陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli) 的抑制作用是通過(guò)一種非黑色素封裝的形式，即血細(xì)胞在細(xì)菌周圍聚集，從而將其隔離并最終消化，此過(guò)程稱為結(jié)節(jié)化。而體積太大不能被吞噬或結(jié)節(jié)化破壞的病原體，如寄生蟲和線蟲，蜱血細(xì)胞可通過(guò)包裹來(lái)消除[22]。

2.1.2原始補(bǔ)體系統(tǒng) 蜱血細(xì)胞對(duì)微生物的吞噬作用與一個(gè)原始補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)。蜱具有原始的補(bǔ)體系統(tǒng)，包括TEPs、纖維蛋白原相關(guān)凝集素和轉(zhuǎn)化酶因子[23]。α2-巨球蛋白家族屬于TEPs，是進(jìn)化上最古老、最保守的天然免疫成分。墨巴鈍緣蜱中分離的α2-巨球蛋是蜱類中描述的第1種TEPs，隨后在蓖子硬蜱中也分離出α2-巨球蛋白。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默蓖子硬蜱血淋巴中α2-巨球蛋白，可顯著降低蜱血細(xì)胞對(duì)產(chǎn)吲哚金黃桿菌的吞噬作用，表明α2-巨球蛋白參與了蜱血細(xì)胞對(duì)產(chǎn)吲哚金黃桿菌的吞噬[24]。纖維蛋白原相關(guān)凝集素是一種模式識(shí)別受體，與入侵微生物表面存在的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相互作用，被認(rèn)為是蜱血淋巴內(nèi)自我與非自我識(shí)別的關(guān)鍵。通過(guò)RNAi沉默蓖子硬蜱凝集素基因ixoderins，再將蜱血淋巴加到含大腸桿菌或白色念珠菌(Canidiaalbicans)培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默ixoderins顯著降低蜱血細(xì)胞對(duì)兩種菌的吞噬作用，表明ixoderins介導(dǎo)了蜱血細(xì)胞對(duì)大腸桿菌和白色念珠菌的吞噬[25]。

2.2 體液免疫

2.2.1抗菌肽 蜱血淋巴中還存在多種類型的體液因子，它們是體液免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。蜱類可通過(guò)這些體液因子保護(hù)自己免受微生物感染，其包括防御素、溶菌酶、凝集素以及一些蛋白酶抑制劑等，而蜱類防御素的報(bào)道最常見。防御素主要通過(guò)與入侵微生物的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)或膜電位，最終殺死靶細(xì)胞。希伯來(lái)花蜱(Amblyommahebraeum)血淋巴中存在兩種非陽(yáng)離子防御素，體外抑菌試驗(yàn)表明，它們對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抗菌活性[26]。此外，美洲花蜱(Amblyommaamericanum) 、蓖子硬蜱、微小扇頭蜱、森林革蜱(Dermacentorsilvarum) 和墨巴鈍緣蜱中都已鑒定出防御素的存在。變異革蜱侵染大腸桿菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，蜱血淋巴中c型溶菌酶表達(dá)水平升高，表明c型溶菌酶參與了蜱對(duì)大腸桿菌的先天免疫防御[27]。

2.2.2凝集素 凝集素是含有特異性單聚糖或低聚糖結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)或糖蛋白，可特異性地識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌、真菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上的碳水化合物分子,特別是唾液酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺[29]。這種特異性結(jié)合用于識(shí)別革蘭陰性細(xì)菌。此外，凝集素可誘導(dǎo)細(xì)菌凝集；也可作為受體識(shí)別微生物，增強(qiáng)血細(xì)胞對(duì)微生物的吞噬作用[29]。Dorin M是從墨巴鈍緣蜱血淋巴中純化的第1個(gè)蜱凝集素，是一種糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約640 kDa。其在血細(xì)胞中合成并分泌到血淋巴中，可作為模式識(shí)別分子發(fā)揮作用，參與蜱的先天免疫[30]。

2.2.3蛋白酶抑制劑 微小扇頭蜱血細(xì)胞中的絲氨酸蛋白酶抑制劑也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，推測(cè)是通過(guò)抑制病原體中絲氨酸蛋白酶活性引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但其抗菌活性的分子機(jī)制尚不清楚[31]。

3 蜱唾液腺免疫

蜱類唾液腺的主要功能是濃縮血液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并分泌具有藥理活性的分子，同時(shí)將多余水分和離子返回宿主體內(nèi)。蜱經(jīng)唾液將病原體傳播給宿主，這是蜱源性病原體傳播的最常見途徑[32]。因此，蜱類唾液腺和唾液在調(diào)節(jié)蜱-病原體-宿主界面的免疫反應(yīng)中起著不可或缺的作用。

但已發(fā)現(xiàn)的唾液中對(duì)病原體有防御作用的因子尚少。隨著硬蜱和軟蜱唾液腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)量的增加，有研究發(fā)現(xiàn)蜱唾液腺組織中有多種AMPs的表達(dá)，例如防御素和溶菌酶[33-35]。Ixosin-B是從中華硬蜱(Ixodessinensis) 唾液腺純化出的防御素，其對(duì)細(xì)菌和真菌均具有抗菌活性[36]。長(zhǎng)角血蜱唾液腺中一種名為longicornisin的防御素樣肽,相對(duì)分子質(zhì)量約為10 kDa，其對(duì)幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)和真菌也具有較強(qiáng)的抑菌活性[37]。長(zhǎng)角血蜱在被金黃色葡萄球菌或大腸桿菌侵染后，唾液腺中的溶菌酶基因轉(zhuǎn)錄水平升高，表明該溶菌酶參與了長(zhǎng)角血蜱對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的先天免疫防御[38]。

凝集素OMFREP和Ixoderin B分別在墨巴鈍緣蜱和蓖子硬蜱的唾液腺中被檢測(cè)到，與鱟凝集素序列相似，推測(cè)其與先天免疫有關(guān)[39]。鈍刺血蜱(Haemaphysalisdoenitzi)絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，HDS)HDS1和HDS2的抗菌活性實(shí)驗(yàn)表明，其重組蛋白rHDS1和rHDS2對(duì)細(xì)菌和真菌都具有一定的抑制活性，且rHDS1對(duì)白色念珠菌的殺菌作用最強(qiáng)，rHDS2對(duì)新生隱球菌(Cryptococcusneoformans) 具有最強(qiáng)的殺菌作用[40]。然而，這些唾液腺AMPs是否分泌到蜱唾液或血淋巴中，以及是否與病原體直接相互作用，仍未得到證實(shí)。

4 蜱的免疫調(diào)控

蜱的免疫系統(tǒng)通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制來(lái)抵御病原體入侵。昆蟲體內(nèi)調(diào)節(jié)先天性免疫的信號(hào)通路分別是Toll、IMD(immunodeficiency)、JAK-STAT(janus kinase/signal transducers and activators of transcription),這3條通路在信號(hào)傳遞過(guò)程中協(xié)同作用[41]。與昆蟲相似，蜱類也存在調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的信號(hào)通路[42]。硬蜱基因組分析表明，蜱體內(nèi)含有Toll、IMD、JAK-STAT免疫通路的大多數(shù)成分，且經(jīng)典免疫的相關(guān)基因和途徑存在顯著多樣性[9]。模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)對(duì)微生物表面PAMPs的識(shí)別能夠觸發(fā)特定免疫信號(hào)通路。

4.1 Toll信號(hào)通路在昆蟲中，肽聚糖識(shí)別受體蛋白(peptidoglycan recognition receptor proteins,PGRPs)可識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的賴氨酸型肽聚糖；革蘭陰性結(jié)合蛋白(gram-negative binding proteins,GNBPs)可識(shí)別真菌的β-1,3-葡聚糖[43]。PGRPs或GNBPs可與PAMPs結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞外ModSP和Grass的激活。Spz被裂解并與Toll受體結(jié)合，接著Toll受體與Myd88二聚體結(jié)合并激活與蛋白激酶Pelle相互作用的適配分子Tube，使Cactus被磷酸化后降解，導(dǎo)致Diff和Dorsal基因上調(diào)，最終調(diào)控AMPs的表達(dá)[44]。蜱與昆蟲比較，其Toll通路含有除GNBPs和Diff之外的所有關(guān)鍵基因，提示蜱中存在Toll信號(hào)通路，且在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

4.2 IMD信號(hào)通路革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分二氨基庚二酸型肽聚糖可與果蠅細(xì)胞內(nèi)或跨膜肽聚糖識(shí)別蛋白結(jié)合，激活I(lǐng)MD信號(hào)通路并觸發(fā)特異性AMPs的合成[45]。在蜱中未發(fā)現(xiàn)IMD途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵成分，如跨膜PGRPs、IMD、dFADD等，但XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis)可直接與Bendless結(jié)合調(diào)控蜱體內(nèi)IMD途徑，激活蛋白TAB2、TAK1、IKKγ和IKKβ，并磷酸化Relish，誘導(dǎo)AMPs的轉(zhuǎn)錄生成[44]。研究表明，細(xì)菌感染微小扇頭蜱時(shí)，IMD通路tak1、tab2、ikkγ、ikkβ等基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)[46]。這些研究為深入研究蜱類IMD途徑提供依據(jù)。

圖1 果蠅與蜱中Toll通路比較[44]

圖2 果蠅與蜱中IMD通路比較[44]

4.3 JAK-STAT信號(hào)通路JAK-STAT信號(hào)通路可能參與昆蟲的抗病毒免疫應(yīng)答，該途徑不是由病毒配體直接引起的，而是由細(xì)胞感染過(guò)程中釋放的細(xì)胞因子所誘導(dǎo)[47]。JAK-STAT途徑所有下游成分在微小扇頭蜱和肩突硬蜱基因組中被檢測(cè)出來(lái)，包括跨膜細(xì)胞因子受體Domeless、酪氨酸激酶JAK、轉(zhuǎn)錄因子STAT、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)適配分子STAM、抑制劑蛋白PIAS和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑SOCS[46]。研究發(fā)現(xiàn)，肩突硬蜱 (Ixodesscapularis)中一類編碼5.3 kDa AMPs家族的基因表達(dá)直接受到STAT轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，該基因在嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體感染蜱過(guò)程中顯著上調(diào)。用RNAi干擾JAK-STAT信號(hào)通路后，嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體在蜱唾液腺和血淋巴中的感染水平顯著升高。結(jié)果表明，蜱類通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路調(diào)控這一類AMPs基因的表達(dá)，以抑制嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的感染[48]。

5 總結(jié)與展望

蜱的媒介能力與其免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，但我們對(duì)蜱先天免疫的總體認(rèn)知遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于昆蟲。蜱與昆蟲先天免疫反應(yīng)機(jī)制具有一定的相似性，因而可通過(guò)分子生物學(xué)、免疫學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究，促進(jìn)蜱先天免疫的研究。隨著多種蜱基因組的公布以及RNAi技術(shù)干擾蜱的可行性，有助于闡明蜱體內(nèi)先天免疫反應(yīng)的分子機(jī)制以及各分子在先天免疫中的調(diào)控作用[49]。此外，全面了解蜱類先天免疫，找到其免疫信號(hào)通路及免疫反應(yīng)中關(guān)鍵基因，為篩選新的靶標(biāo)位點(diǎn)，有效防控蜱及蜱媒疾病提供科學(xué)依據(jù)。