楊曉飛， 申煥君， 黃高鉑， 連建奇， 張 野

1 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院) 傳染病科， 西安 710038；2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科， 西安 710061

急性HBV感染可誘導(dǎo)多克隆病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖分化，殺傷病毒感染的肝細(xì)胞，在清除HBV的同時(shí)可造成嚴(yán)重肝損傷。慢性HBV感染可誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，造成免疫逃逸，無(wú)法有效清除病毒，導(dǎo)致感染慢性化[1]。因此，HBV感染的臨床結(jié)局是病毒感染與機(jī)體免疫應(yīng)答復(fù)雜相互作用的結(jié)果[2]。自然殺傷(natural killer，NK)樣B淋巴細(xì)胞是一類(lèi)新鑒定的免疫細(xì)胞亞群，NKB淋巴細(xì)胞兼具NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的表型，通過(guò)分泌IL-12和IL-18調(diào)控NK細(xì)胞和固有淋巴樣細(xì)胞功能，在病原體感染早期即可發(fā)揮有效免疫調(diào)控和抗感染活性[3]。但有關(guān)NKB淋巴細(xì)胞在HBV感染中的分布和臨床意義罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究分析了HBV感染者中NKB淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞亞群的變化和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月—2018年12月就診于唐都醫(yī)院傳染科的HBV感染者，包括急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者、無(wú)癥狀HBV攜帶者(asymptomatic HBV carrier，ASC)。AHB納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往無(wú)乙型肝炎病史；(2)HBsAg陽(yáng)性、HBV DNA陽(yáng)性；(3)ALT水平升高超過(guò)5倍正常值上限；(4)抗-HBc IgM 陽(yáng)性；(5)6個(gè)月內(nèi)HBsAg和HBV DNA均陰轉(zhuǎn)。CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBsAg陽(yáng)性大于6個(gè)月；(2)HBV DNA陽(yáng)性；(3)ALT水平超過(guò)2倍正常值上限。ASC納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性、HBV DNA陽(yáng)性；(2)ALT水平在正常范圍內(nèi)。所有患者既往均未接受抗病毒治療，年齡>18歲。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)同時(shí)期在唐都醫(yī)院行健康查體者；(2)年齡>18歲；(3)既往無(wú)HBV感染病史和乙型肝炎家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嗜肝病毒感染或HIV感染者；(2)合并自身免疫性疾病、酒精性肝硬化、藥物性肝損傷者；(3)合并惡性腫瘤者；(4)合并失代償期肝硬化、肝衰竭、肝癌等終末期肝病者；(5)妊娠或哺乳期婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。小鼠抗人CD3-FITC、小鼠抗人CD19-APCH7、小鼠抗人CD16-APC、小鼠抗人CD56-PerCP Cy5.5均購(gòu)自美國(guó)BD公司。人IL-18和IFNγ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物技術(shù)公司。IFNγ酶聯(lián)斑點(diǎn)吸附試驗(yàn)(ELISPOT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞典Mabtech公司。FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。ELISA微孔讀板儀為美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品。ELISPOT讀板儀為德國(guó)AID公司產(chǎn)品。

1.2.2 血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離 清晨、空腹采集EDTA抗凝外周血靜脈血10 mL，于4 ℃、1000 r/min離心10 min分離血漿，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩ＪＳ嘌?xì)胞立即使用淋巴細(xì)胞分離液、采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。使用0.4%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)PBMC計(jì)數(shù)，以5×106個(gè)/管分裝在凍存管中，加入90%胎牛血清+10%二甲基亞砜?jī)龃嬗谝旱袀溆谩?/p>

1.2.3 流式細(xì)胞檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群比例 復(fù)蘇PBMC，取106個(gè)PBMC，轉(zhuǎn)入FACS管中，洗滌2次后加入小鼠抗人CD3-FITC、小鼠抗人CD19-APC H7、小鼠抗人CD16-APC、小鼠抗人CD56-PerCP Cy5.5進(jìn)行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后進(jìn)行流式檢測(cè)。使用FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，BD FACS Diva軟件獲取細(xì)胞，F(xiàn)lowJo V10軟件分析結(jié)果。NKB淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的流式分析策略：首先根據(jù)前向角散射和側(cè)向角散射對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行圈門(mén)，在淋巴細(xì)胞門(mén)內(nèi)分析CD3-CD19+細(xì)胞，即為B淋巴細(xì)胞。在CD3-CD19+門(mén)內(nèi)，分析CD16+CD56+細(xì)胞，即為NKB淋巴細(xì)胞。在淋巴細(xì)胞門(mén)內(nèi)分析CD3-CD19-細(xì)胞，在CD3-CD19-門(mén)內(nèi)，分析CD16和CD56表達(dá)，分析不同NK細(xì)胞亞群，包括：CD3-CD19-CD56highCD16-NK細(xì)胞、CD3-CD19-CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD3-CD19-CD56-CD16+NK細(xì)胞(圖1)。

圖1 外周血NKB淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的流式分析策略

1.2.4 ELISA檢測(cè)血漿IL-18和IFNγ水平 使用商品化的ELISA試劑盒對(duì)血漿中IL-18和 IFNγ水平進(jìn)行檢測(cè)，操作按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.2.5 ELISPOT檢測(cè)HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞分泌 IFNγ水平 使用抗IFNγ(0.5 μg/mL)包被96孔PVDF膜板，4 ℃孵育過(guò)夜，向每孔中加入105個(gè)PBMC(100 μL)和HBV全基因組多肽(15肽，每條多肽之間有5個(gè)氨基酸重疊，共313條；10 μg/mL)[5]，37 ℃、5%CO2條件下刺激培養(yǎng)16 h，洗滌后每孔加入100 μL生物素標(biāo)記的抗IFNγ單抗，室溫孵育60 min，洗滌后每孔加入100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈球菌親和素，室溫避光孵育45 min，洗板后加入顯色劑反應(yīng)15 min，終止反應(yīng)后讀板，以斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(spot forming cells, SFC)/106PBMC為單位計(jì)數(shù)產(chǎn)生IFNγ的細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入AHB患者15例，CHB患者30例，ASC 29例，對(duì)照者12例。入組受試者一般資料見(jiàn)表1。

表1 入組受試者一般資料比較

2.2 HBV感染者外周血NKB淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞比例和IL-18、IFNγ水平變化 CD3-CD19+CD16+CD56+NKB淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例在AHB患者、CHB患者、ASC和對(duì)照者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.42，P<0.000 1)，CHB患者NKB淋巴細(xì)胞比例[(0.79±0.13)%]顯著低于AHB患者[(0.94±0.15)%]、ASC[(1.02±0.12)%]和對(duì)照者[(1.11±0.27)%](P值均<0.001)(圖2a)。CD3-CD19-CD56highCD16-NK細(xì)胞、CD3-CD19-CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD3-CD19-CD56-CD16+NK細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例在AHB患者、CHB患者、ASC和對(duì)照者之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為0.598、0.505、1.950、1.676，P值均>0.05)(圖2b～e)。血漿IL-18水平在AHB患者、CHB患者、ASC和對(duì)照者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.733，P=0.001)，CHB患者IL-18水平[(259.30±70.09)pg/mL]顯著低于AHB患者[(336.00±103.00)pg/mL]和對(duì)照者[(319.30±64.80)pg/mL](P值均<0.05)，ASC IL-18水平[(258.60±59.82)pg/mL]亦顯著低于AHB患者和對(duì)照者(P值均<0.01)，但血漿IL-18水平在CHB患者和ASC之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.965)(圖2f)。血漿IFNγ水平在AHB患者、CHB患者、ASC和對(duì)照者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.737，P=0.004)，CHB患者IFNγ水平[(11.79±2.47)pg/mL]顯著低于AHB患者[(14.55±3.81)pg/mL]、ASC[(13.79±2.82)pg/mL]和對(duì)照者[(14.50±2.42)pg/mL](P<0.01)(圖2g)。

注：a，CD3-CD19+CD16+CD56+NKB淋巴細(xì)胞；b，CD3-CD19-CD56highCD16-NK細(xì)胞；c，CD3-CD19-CD56+CD16+NK細(xì)胞；d，CD3-CD19-CD56-CD16+NK細(xì)胞；e，B淋巴細(xì)胞；f，IL-18；g，IFNγ。

2.3 HBV感染者中NKB淋巴細(xì)胞與臨床指標(biāo)相關(guān)性 AHB患者、CHB患者和ASC中NKB淋巴細(xì)胞和IL-18與HBV DNA定量、ALT水平均無(wú)相關(guān)性(P值均>0.05)。AHB患者和ASC中NKB淋巴細(xì)胞與IL-18水平無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，CHB患者中NKB淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例與血漿IL-18水平呈正相關(guān)(r=0.432，P=0.017)(圖3a)，CHB患者中NKB淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例與血漿IFNγ水平無(wú)相關(guān)性(r=-0.018，P=0.923)(圖3b)，但CHB患者中NKB淋巴細(xì)胞比例與病毒特異性CD8+T淋巴細(xì)胞分泌IFNγ水平呈顯著正相關(guān)(r=0.493，P=0.006)(圖3c)。

注：a，NKB淋巴細(xì)胞比例與血漿IL-18水平相關(guān)性分析；b，NKB淋巴細(xì)胞比例與血漿IFNγ水平相關(guān)性分析；c，NKB淋巴細(xì)胞比例與病毒特異性CD8+T淋巴細(xì)胞分泌IFNγ水平相關(guān)性分析。

3 討論

本研究首次對(duì)新近鑒定的淋巴細(xì)胞亞群——NKB淋巴細(xì)胞在HBV感染者中的變化進(jìn)行分析。NKB淋巴細(xì)胞雖然兼具NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的標(biāo)記，在小鼠中的表型為CD3-CD19+NK1.1+[3]，在人類(lèi)中的表型為CD3-CD19+(或CD20+)NKp46+[3,7-8]，但NKB淋巴細(xì)胞的功能卻尚未完全闡明。Kerdiles等[9]認(rèn)為，雖然NKB淋巴細(xì)胞具有NK細(xì)胞的表型，但在功能上與傳統(tǒng)B淋巴細(xì)胞基本相似。但Wang等[3]則認(rèn)為，NKB淋巴細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-18和IL-12在微生物感染早期階段活化NK細(xì)胞和固有淋巴樣細(xì)胞，發(fā)揮抗感染免疫活性，這一功能活性亦在猴免疫缺陷病毒感染中得到證實(shí)[10]。本課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，NKB淋巴細(xì)胞在牙周炎患者外周血和牙周組織中的水平均顯著升高，并主要通過(guò)分泌IL-18發(fā)揮促進(jìn)牙周組織炎癥應(yīng)答的作用。新近的研究[11]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者外周血和腫瘤浸潤(rùn)NKB淋巴細(xì)胞比例及其分泌的IL-18水平均顯著降低。但有關(guān)NKB淋巴細(xì)胞在HBV感染中的數(shù)量和功能的變化尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用經(jīng)典N(xiāo)K細(xì)胞表型(CD3-CD16+CD56+)和B淋巴細(xì)胞表型(CD3-CD19+)對(duì)HBV感染者外周血中CD3-CD19+CD16+CD56+NKB淋巴細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHB患者和ASC外周血NKB淋巴細(xì)胞比例與對(duì)照者無(wú)顯著差異，但CHB患者中NKB淋巴細(xì)胞比例則顯著低于對(duì)照者。在對(duì)NKB淋巴細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-18的表達(dá)水平進(jìn)行分析時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，CHB患者和ASC中IL-18表達(dá)水平下降，這與既往研究[12]基本一致。

NKB淋巴細(xì)胞比例和IL-18水平與病毒復(fù)制、肝臟炎癥均無(wú)顯著相關(guān)性。由于既往的研究主要集中在NKB淋巴細(xì)胞在急性病毒感染中的作用，本研究未發(fā)現(xiàn)AHB患者中存在NKB淋巴細(xì)胞數(shù)量變化，提示NKB淋巴細(xì)胞可能并未直接參與急性HBV感染的病程。而ASC和CHB是慢性HBV感染自然史的2個(gè)不同階段，多數(shù)患者在青少年階段處于免疫耐受期，病毒處于高水平復(fù)制，肝臟炎癥應(yīng)答輕，隨著疾病進(jìn)展，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)感染病毒的肝細(xì)胞進(jìn)行殺傷，清除病毒的同時(shí)誘導(dǎo)肝臟炎癥損傷[13-14]。因此，本研究入組的ASC較CHB患者年齡小，但NKB淋巴細(xì)胞和IL-18與年齡無(wú)顯著相關(guān)性。NKB淋巴細(xì)胞僅在CHB患者中降低，在ASC中無(wú)明顯變化，而IL-18在CHB患者和ASC中均顯著降低，但僅在CHB患者中NKB淋巴細(xì)胞與IL-18呈顯著正相關(guān)。這可能說(shuō)明由于ASC患者處于免疫耐受階段，NKB淋巴細(xì)胞活性尚未受到抑制，ASC患者中其他分泌IL-18的細(xì)胞(如單核細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等)亦可能被抑制，導(dǎo)致IL-18水平下降。而進(jìn)入免疫清除期后，長(zhǎng)期病毒持續(xù)感染仍可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞失能，造成NKB淋巴細(xì)胞水平下降，其分泌的IL-18水平亦降低，不能清除病原體和誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答，加重病毒持續(xù)感染。因此，NKB淋巴細(xì)胞水平下降可能與HBV感染自然史密切相關(guān)。此外，CHB患者外周血中NKB淋巴細(xì)胞降低亦可能與疾病過(guò)程中NKB淋巴細(xì)胞向肝臟的募集浸潤(rùn)有關(guān)。新近的研究[15]發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中NKB淋巴細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-18調(diào)控CD8+T淋巴細(xì)胞活性。本研究發(fā)現(xiàn)，NKB淋巴細(xì)胞比例與分泌IFNγ的HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞水平呈顯著正相關(guān)，提示在CHB疾病過(guò)程中，NKB淋巴細(xì)胞也可能參與了病毒特異性CD8+T淋巴細(xì)胞功能調(diào)控。但本研究未納入ASC和CHB患者的肝穿刺標(biāo)本，仍需要使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行研究加以證實(shí)。

本課題組既往研究[16]發(fā)現(xiàn)，HBV質(zhì)粒高壓尾靜脈注射誘導(dǎo)的HBV感染小鼠模型肝臟中NK細(xì)胞比例與對(duì)照小鼠無(wú)顯著差異，本研究在HBV感染者中亦發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。NK細(xì)胞根據(jù)CD16和CD56表達(dá)水平可分為CD56highCD16-NK細(xì)胞、CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD56-CD16+NK細(xì)胞。CD56highCD16-NK細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫調(diào)控；CD56+CD16+NK細(xì)胞是成熟的、具有細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞亞群，通過(guò)CD16發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的毒性作用；CD56-CD16+NK細(xì)胞則是失能的NK細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性作用均顯著降低，增殖能力亦低下[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染者中三類(lèi)NK細(xì)胞亞群比例與對(duì)照者均無(wú)顯著差異，這與既往發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在AHB患者和CHB患者中受到抑制的趨勢(shì)不盡相同[18]，這可能與分析NK細(xì)胞不同亞型時(shí)采用的細(xì)胞表面標(biāo)志不同有關(guān)。NK細(xì)胞通過(guò)分泌IFNγ介導(dǎo)后續(xù)適應(yīng)性免疫活化促進(jìn)HBV清除[19]，因此本研究亦對(duì)血清中IFNγ水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHB患者血漿IFNγ水平顯著降低，這與本課題組既往研究[20]結(jié)果一致，但與NK細(xì)胞亞群變化趨勢(shì)不盡相同，這可能由于NK細(xì)胞并非為血漿中IFNγ的唯一細(xì)胞來(lái)源有關(guān)。既往有研究[21-22]發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBeAg可誘導(dǎo)成熟的NK細(xì)胞功能活性下降，導(dǎo)致HBV感染者疾病進(jìn)展，促進(jìn)失代償期肝硬化、肝癌等終末期肝病發(fā)生。B淋巴細(xì)胞在HBV感染過(guò)程中發(fā)揮誘導(dǎo)抗病毒抗體產(chǎn)生、抗原提呈等多種功能[23]，但本研究中亦未發(fā)現(xiàn)HBV感染者和對(duì)照者外周血B淋巴細(xì)胞比例存在明顯差異。因此，HBV感染者中NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞功能的變化仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究為橫斷面研究，針對(duì)AHB患者和CHB患者未進(jìn)行治療前后不同免疫細(xì)胞亞群的比較，這也是本研究的薄弱環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，慢性HBV感染可能誘導(dǎo)NKB淋巴細(xì)胞水平下降，NKB淋巴細(xì)胞及其分泌的IL-18參與HBV感染慢性化，與慢性HBV感染自然史相關(guān)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2015年5月21日經(jīng)由空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：TDLL-201505-013，所有入組受試者均簽署知情同意書(shū)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊曉飛、申煥君、黃高鉑負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作和論文撰寫(xiě)；楊曉飛、連建奇、張野負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析；連建奇、張野負(fù)責(zé)入組患者、課題設(shè)計(jì)、指導(dǎo)論文撰寫(xiě)并最后定稿。