胡亞欣， 程 卓， 叢 碩， 劉詠梅， 張寶芳， 雷 榆， 嚴(yán) 昭，張懿煒， 蒲 茜， 余 蕾， 程明亮

1 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院a.產(chǎn)前診斷中心， b.輸血科， c.檢驗(yàn)科， d.感染科， 貴陽 550004；2 北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科， 北京 100191； 3 貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院, 貴陽 550004；4 貴陽市婦幼保健院， 貴陽 550004

肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson病，是由于銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因ATP7B的突變或缺失而導(dǎo)致銅在體內(nèi)蓄積而引起的疾病，遺傳模式為常染色體隱性遺傳[1]。臨床表現(xiàn)為肝臟損害、神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)、腎臟損傷、出現(xiàn)角膜K-F環(huán)等，涉及機(jī)體多個系統(tǒng)和器官，以肝臟或神經(jīng)系統(tǒng)的損傷為主要表現(xiàn)形式。ATP7B 基因定位于人類染色體13p14.3 上，具有21個外顯子區(qū)域[2]。目前已發(fā)現(xiàn)的有害基因突變有800余種(人類基因突變數(shù)據(jù)庫www.hgmd.org)。研究表明，不同的基因突變位點(diǎn)與不同的臨床表現(xiàn)相關(guān)。

1 病例資料

先證者(圖1，箭頭所示)，男，40歲。于15歲時，出現(xiàn)口齒不清、流涎、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀，角膜K-F環(huán)陽性，被診斷為肝豆?fàn)詈俗冃?，?guī)律服用青霉胺治療后，癥狀逐漸得到控制；血清銅2.20 μmol/L，尿銅1130 μg/24 h。查問家族史，先證者有3個姐妹，其中2個在青少年時期死亡。姐姐在10余歲時，死于劇烈運(yùn)動誘發(fā)的肝衰竭；一個妹妹也在童年時期出現(xiàn)高燒及惡性黃疸，經(jīng)治無效死亡。由于當(dāng)時的診療條件有限，未能明確診斷，但結(jié)合二者病史特點(diǎn)臨床高度疑似肝豆?fàn)詈俗冃?。先證者另一位妹妹(圖1，Ⅱ5)，在先證者確診后，也進(jìn)行了基因檢測，結(jié)果與先證者ATP7B基因突變相同。先證者父親尿銅112 μg/24 h，輕度升高，無其他臨床表現(xiàn)；母親尿銅31 μg/24 h，屬于正常范圍；妹妹139 μg/24 h，輕度升高，無相關(guān)臨床癥狀。

圖1 患者家族系譜圖

經(jīng)對該家系進(jìn)行全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)先證者及其妹妹均有來自于父親的c.2304dupC及來自于母親的c.2975C>T兩個突變。前者是一個罕見的突變，后者在東亞為一個熱點(diǎn)突變[3]。已有報道[4]，先證者與一健康女子結(jié)合，婚后反復(fù)4次自然流產(chǎn)。健在的妹妹33歲，無肝豆?fàn)詈俗冃缘娜魏伟Y狀，檢查發(fā)現(xiàn)尿銅輕度升高，同其父相似。為了探究先證者及其妹妹具有相同基因型，但表型不同的原因，筆者對該家系進(jìn)行了全基因組基因測序、GO及KEGG分析，以明確兄妹二人的基因組差異。

1.1 高通量測序 提取樣品后，通過嚴(yán)格的質(zhì)檢，將合格后的樣品DNA片段隨機(jī)打斷，構(gòu)建文庫，添加adaptor，PCR擴(kuò)增，然后利用illumina機(jī)器進(jìn)行測序。去除低質(zhì)量序列，得到最終的clean reads，分析SNP、Indel、CNV、SV 變異，并用軟件對結(jié)果進(jìn)行注釋。涉及到的軟件包括BWA(Burrows-Wheeler Aligner)0.7.5a-r405、Samtools( Sequence Alignment/Map Tools) 0.1.19、Picard-Tools 1.57、Genome Analysis Toolkit 2.5-2-gf57256b、pindel-v0.2.2、SnpEff、Annovar、KOBAS 2.0、topGO、CREST、CNVnator等。測序深度達(dá)到10X的覆蓋比例均在99%以上，達(dá)到20X的覆蓋比例為93.57%以上。在數(shù)據(jù)庫中比對匹配比例92.72%以上。

1.2 罕見基因突變分析 篩選過濾已知數(shù)據(jù)庫(千人數(shù)據(jù)庫、400Kberry、ESP6500)，過濾掉高頻位點(diǎn)(頻率>5%)的突變，并對銅離子吸收代謝過程中的直接或間接相關(guān)基因ATP7A、ATP7B、ADNP、APOA4、ATOX1、CCS、COX17、COX11、PAM、PRND、SNCA、SOD1等進(jìn)行逐個分析比對。在家系中共發(fā)現(xiàn)了15 865個罕見基因位點(diǎn)突變，3667個indel短序列插入或缺失片段，4148個CNV變異，以及1044個SV變異。對銅離子代謝相關(guān)基因突變進(jìn)行逐個分析，發(fā)現(xiàn)先證者的ATP7A、ATP7B、ADNP、APOA4、ATOX1、CCS、COX17、COX11、PAM、PRND、SNCA等多個銅代謝相關(guān)基因發(fā)生了突變，大部分突變無明確致病性，且某些突變發(fā)生在內(nèi)含子上。筆者繼續(xù)對非同義突變的SNP位點(diǎn)所在的基因，用topGO軟件對目標(biāo)基因進(jìn)行GO富集分析。

1.3 GO和KEGG分析 GO分析顯示雖然兄妹二人在致病基因ATP7B上的突變位點(diǎn)相同，但是在全基因組層面富集的SNP顯示了二人在生物過程、分子功能、細(xì)胞組分上的差異。根據(jù)P值的大小，列出了前15個差異顯著的條目，值得注意的是，先證者在基于Indel的GO分析，與銅離子結(jié)合的分子功能(GO:0005507)上，有明顯差異，P值為0.014 56；而先證者妹妹前20個GO差異里則不包含這一項(xiàng)目(圖2)?；蛲蛔兣c臨床表型之間有著復(fù)雜的基因調(diào)控機(jī)制，尚需要進(jìn)一步研究。

注：a，先證者妹妹的基因突變富集的GO分子功能分析；b，先證者基因突變富集的GO分子功能。

2 討論

人體每天從食物中吸收2～5 mg的銅離子，大部分在體內(nèi)經(jīng)過銅藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至各個部位，多余的銅離子經(jīng)膽汁排泄，通常情況下尿銅不超過50 μg/24 h。多個基因參與了銅離子的吸收和代謝。首先，細(xì)胞通過hCTR1吸收銅，一系列銅伴侶分子(ATOX1、CCS、COX17等)將銅離子運(yùn)送至各個組織器官[3]。ATOX1與ATP7B相結(jié)合，調(diào)控ATP7B的N-末端活性[5]，同時其也可以調(diào)控ATP7B在細(xì)胞內(nèi)的位置等[6]。ATP7B基因編碼P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，主要在肝臟中高表達(dá)，通過金屬結(jié)合位點(diǎn)與銅離子結(jié)合，將銅離子從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，并將過量的銅從肝臟通過膽汁排泄。正常生理狀態(tài)下，ATP7B蛋白在高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)中聚集，轉(zhuǎn)運(yùn)胞質(zhì)中由ATOX1蛋白傳遞而來的銅離子，這些銅離子將用于血漿銅藍(lán)蛋白的生物合成；當(dāng)銅離子濃度增加到一定程度之后，ATP7B蛋白從高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)上解離，向肝細(xì)胞面的膽小管移動，通過膽汁將多余的銅排出體外[7]。若ATP7B基因突變，則導(dǎo)致銅離子外排通路障礙，銅離子超載，在細(xì)胞內(nèi)蓄積。

肝豆?fàn)詈俗冃宰鳛锳TP7B基因突變導(dǎo)致的單基因遺傳病，其發(fā)病規(guī)律與基因突變位點(diǎn)關(guān)系密切，其發(fā)病年齡常在10～30歲[8]。不同位點(diǎn)突變對ATP7B功能的影響存在差異，并可能與不同的臨床表現(xiàn)相關(guān)。ATP7B基因突變在亞洲人群中最常見的突變是p.Arg778Leu，歐美人群中為p.His1069Gln[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，p.L492S、p.V519M、p.E541K、p.L549P、p.A604P、p.R616W、p.P992L、p.N1270S等突變往往預(yù)示著發(fā)病年齡較早，而具有p.I1148T突變的患者則大多在12歲后發(fā)病。本案例中兄妹二人均攜帶來自母源的p.P992L這一突變，先證者和其已故姐妹的發(fā)病年齡均為10～15歲，符合上述觀點(diǎn)。先證者小妹同樣攜帶這一突變，在33歲仍未發(fā)病。由圖3可以看出，該2個位點(diǎn)突變的部位在ATP結(jié)合域之前，分別在第4和第6跨膜結(jié)構(gòu)上，其中一個來自父親的突變c.2304dupC為移碼突變，可能會造成該蛋白的功能完全喪失，這可以用來解釋先證者父親尿銅升高。但不排除其他多種可能性導(dǎo)致這種情況發(fā)生，比如銅離子的攝入不足(限銅飲食)、排出增加、機(jī)體對銅離子的耐受程度等。

圖3 ATP7B結(jié)構(gòu)及患者突變所在位置

在相同的基因型的情況下，盡管起病癥狀可能不同，但是發(fā)病年齡常較為相近[11-13]。但是也有些許個例，兄弟姐妹的發(fā)病年齡差異很大。曾有文獻(xiàn)[10]報道了一對姐弟，姐姐于72歲因亞急性肝衰竭和神經(jīng)功能癥狀而被確診，弟弟45歲開始出現(xiàn)輕微手部震顫，但因癥狀較輕而被忽略，在姐姐確診后才診斷為肝豆?fàn)詈俗冃裕蓑?qū)銅治療后癥狀均有改善。之前也有過同一家庭內(nèi)有孩子16歲發(fā)病后，其姐姐38歲發(fā)病的報道。筆者推測可能和等位基因的表達(dá)優(yōu)勢相關(guān)[14]。上述報道均為弟弟先發(fā)病，而姐姐遲發(fā)，存在性別差異。肝豆?fàn)詈俗冃阅信疾「怕氏嗤?，但是癥狀仍然具有性別差異：男性更易出現(xiàn)神經(jīng)癥狀；女性常首先出現(xiàn)肝損害，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀更晚[2]。這種現(xiàn)象可能與雌激素對神經(jīng)的保護(hù)作用有關(guān)。

在本例家系中，相同基因型的兄妹間表現(xiàn)出了銅代謝指標(biāo)及發(fā)病情況的極大差異。肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床表型受多種因素的影響[15]，ATP7B基因突變類型只是其中一部分。目前已研究的潛在影響因素包括修飾基因如ApoE[16]、MTHFR[17]、銅代謝MURR1結(jié)構(gòu)域1[18]、氧化應(yīng)激過程中的酶[19]、DNA甲基化以及飲食中的膽堿[20-21]、雌激素的保護(hù)作用等，均能影響肝豆?fàn)詈俗冃缘牟∏檩p重。動物實(shí)驗(yàn)[19]表明，肝豆?fàn)詈俗冃孕∈竽Ｐ偷牡图谆癄顟B(tài)可由增加攝食中的膽堿含量而恢復(fù)至正常水平，同時肝臟病變有所改善。但在人類疾病過程中，甲基化對表型影響的程度尚無確切的報道。

肝豆?fàn)詈俗冃圆煌R床表型與性別、飲食、修飾基因、甲基化調(diào)控等多種因素相關(guān)，期待未來有更多的研究加以關(guān)注，并為肝豆?fàn)詈俗冃詭砀嗟闹委煼绞健?/p>

倫理學(xué)聲明：本例報告已獲得患者知情同意。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡亞欣、余蕾對研究的思路或設(shè)計有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；張寶芳、程卓、叢碩、劉詠梅、雷榆、蒲茜、嚴(yán)昭、張懿煒負(fù)責(zé)研究數(shù)據(jù)的獲取分析；胡亞欣、程卓參與起草和修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；程明亮負(fù)責(zé)審核并最終定稿。