賈仲昕，趙佳男，季 芳，王 雪，李 剛，王承民，秦建華

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所/廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260）

【研究意義】2020 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全面禁止除中藥外一切促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑的使用，標(biāo)志著我國(guó)畜牧生產(chǎn)和養(yǎng)殖業(yè)“無(wú)抗時(shí)代”的到來(lái)。而蛋白酶一方面可以提高動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化并促進(jìn)對(duì)養(yǎng)分的吸收，另一方面還可以有效減少進(jìn)入后腸中的未消化蛋白數(shù)量，減少腸道菌群失衡的可能，從而保障動(dòng)物腸道健康，因此蛋白酶成為抗生素促生長(zhǎng)劑替代品的選擇之一［1-2］。目前市場(chǎng)上的飼用蛋白酶主要由芽孢桿菌產(chǎn)生，因此探究影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)胞外蛋白酶被認(rèn)為參與細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可以產(chǎn)生至少8 種獨(dú)特的胞外或細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶［3］，包括枯草桿菌蛋白酶AprE、中性金屬蛋白酶NprE、絲氨酸蛋白酶Epr 和Vpr、桿狀肽酶F（Bpr）、中性蛋白酶B（NprB）、細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶WprA 和金屬蛋白酶Mpr。Yang 等［4］研究表明，蛋白酶基因缺失的唯一表型效應(yīng)是蛋白酶活性的喪失。目前，芽孢桿菌蛋白酶基因的相關(guān)報(bào)道多集中于研究蛋白酶基因的調(diào)控機(jī)制以及高產(chǎn)蛋白酶突變株的誘導(dǎo)。Liu 等［5］發(fā)現(xiàn)degU和spo0A以及kinA的上調(diào)部分導(dǎo)致B.pumilus突變株SCU11 堿性蛋白酶的高產(chǎn)量。Zhou 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）中反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Spo0A 可能直接參與aprE的轉(zhuǎn)錄與激活。Zolfaghari 等［7］通過(guò)點(diǎn)突變等系統(tǒng)生物學(xué)方法，使aprE基因的表達(dá)水平和枯草桿菌蛋白酶E（Subtilisin E）的穩(wěn)定性得到提高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌全基因組信息可以更加容易獲得。通過(guò)比較不同菌種的基因組信息并結(jié)合細(xì)菌的相關(guān)表型，可以深入分析造成細(xì)菌表型差異的重要基因［8］。此外，芽孢桿菌全基因組注釋信息的完善也為利用比較基因組學(xué)分析影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因提供了研究基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)15 株芽孢桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)檢測(cè)15株芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力，利用比較基因組學(xué)，挖掘影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因，分析芽孢桿菌基因組中胞外蛋白酶基因與產(chǎn)蛋白酶能力的關(guān)聯(lián)性，為產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試15 株菌株來(lái)源于廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，具體如下：

枯草芽孢桿菌（B.subtiliis）N1282-4at、N1108-5at、N1303-2Ay，貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）C1，蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）N435-1，高地芽孢桿菌（B.altitudinis）N435-3，巨大芽孢桿菌（B.megaterium）N447-3、B1，假真菌樣芽孢桿菌（B.pseudomycoides）N451-2，海洋芽孢桿菌（B.oceanisediminis）N497-ZHONG，阿耶波多氏芽孢桿菌（B.aryabhattai）B2，副短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）B3，芽孢桿菌（Bacillussp.）N470-1、N447-1、A1。

培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)［9-10］并稍作優(yōu)化。蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：酪蛋白10.00、KH2PO40.360、NaH2PO4·2H2O 0.360、MgSO4·7H2O 0.500、FeSO4·7H2O 0.002、CaCl2·2H2O 0.480、NaCl 5.00。篩選培養(yǎng)基配方（g/L）：酪蛋白10.0、牛肉膏粉3.0、Na2HPO42.0、NaCl 5.0、瓊脂15.0、溴麝香草酚藍(lán)0.05。MHB培養(yǎng)基配方（g/L）：酪蛋白水解物17.5、牛肉浸粉5.0、淀粉1.5。NA 培養(yǎng)基配方（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏粉3.0、NaCl 5.0、瓊脂17.0。

1.2 芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力檢測(cè)

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩 取出保藏的細(xì)菌凍存液接種于NA 培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至MHB 培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。將菌液梯度稀釋，吸取100 μL 涂布于酪蛋白瓊脂上，35 ℃培養(yǎng)48 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈直徑（H）和菌落直徑（C）并計(jì)算H與C 的比值H/C。

1.2.2 蛋白酶活性測(cè)定 挑取初篩時(shí)酪蛋白瓊脂上的單菌落，接種至MHB 培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/ min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，將菌液按2%（V/V）接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度OD600為0.500，9 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。蛋白酶活性測(cè)定參考GB/T 23527-2009福林酚法并做適當(dāng)修改。測(cè)定前先將粗酶液與酪蛋白溶液于40 ℃水浴預(yù)熱5 min。

（1）試驗(yàn)組：取1 mL 粗酶液加 入1 mL 10 g/L 酪蛋白溶液，40 ℃水浴10 min。之后立即加入3 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。靜置10 min 后12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液1 mL，加入5.0 mL 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL福林試劑使用溶液，40 ℃水浴顯色20 min，用紫外分光光度計(jì)在680 nm 處測(cè)定樣品的OD680。

（2）對(duì)照組：先加三氯乙酸使蛋白酶失活再加酪蛋白，其他操作同上。

計(jì)算酶活性（X）：

式中，X 為樣品酶活性（U/mL），A 為由樣品測(cè)得的凈OD 值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得相對(duì)應(yīng)的酪氨酸含量，n 為酶液的稀釋倍數(shù)，10 代表反應(yīng)10 min，5 代表5 mL 反應(yīng)液。

酶活性定義：在40 ℃下，每分鐘內(nèi)酪蛋白被水解產(chǎn)生1 μg 酪氨酸為1 個(gè)蛋白酶活性單位（U/mL）。

1.3 芽孢桿菌全基因組測(cè)序

將15 株菌株送至北京百邁客生物科技有限公司，基于Nanopore 測(cè)序技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序。試驗(yàn)流程［11-12］按照ONT 公司提供的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，包括樣品質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序等流程。利用預(yù)測(cè)得到的基因序列與COG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr 等功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，得到基因功能注釋結(jié)果。

1.4 芽孢桿菌蛋白酶基因分析

查找芽孢桿菌中主要報(bào)道的8 種特征化細(xì)胞外或細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶［13］（AprE、NprE、Bpr、Epr、Vp、NprB、WprA、Mpr），以及從細(xì)菌全基因組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶（Serine protease，AprX［14-15］）的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，包括菌株基本信息，蛋白酶基因的種類、數(shù)量和轉(zhuǎn)錄方向，蛋白酶基因間的相對(duì)距離等。利用IBS 線上作圖工具（http://ibs.biocuckoo.org）進(jìn)行 繪圖。從全基因組數(shù)據(jù)結(jié)果中獲取菌株的16S rDNA 序列，結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的數(shù)據(jù)，利用MEGA X 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 菌株蛋白酶基因的 mRNA 水平檢測(cè)

按照菌株產(chǎn)蛋白酶的相關(guān)表型，選取菌株B.altitudinisN435-3、B.oceanisediminisN497-ZHONG、B.velezensisC1、B.subtiliisN1282-4at進(jìn)行蛋白酶基因的mRNA 水平檢測(cè)。根據(jù)細(xì)菌相應(yīng)蛋白酶基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)與合成菌株引物（表1）。提取上述菌株在不同培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基）條件下的總RNA，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qPCR，16S rDNA為內(nèi)參基因。

表1 菌株引物Table 1 Sequences of primers for strains

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus sp.A1 和B.velezensis C1 產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)

在選取的15 株菌株中，有6 株菌株（Bacillussp.A1、B.velezensisC1、B.altitudinisN435-3、B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay）在接種培養(yǎng) 48 h，菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/C）顯著高于其他9 株菌株。Bacillussp.A1 和B.velezensisC1的H/C 值最高，其次為B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay 和B.altitudinisN435-3（圖1）。由于H/C 值在一定程度上反映了細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力［16］，因此上述6株菌株的產(chǎn)蛋白酶能力相對(duì)較強(qiáng)。

圖1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩的H/C 值Fig.1 H/C value of primary screening of protease production strains

由圖2 可知，15 株菌株中蛋白酶活性最高的2株菌株分別為Bacillussp.A1（31.40±0.40 U/mL）和B.velezensisC1（29.75±0.43 U/mL ），蛋白酶活性均達(dá)到 30 U/mL，顯著高于其他13 株菌株；其次為B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay 等3 株菌株，蛋白酶活性在7.40～8.57 U/mL 之間，三者差異不顯著；B.megateriumN447-3 和B.megateriumB1，蛋白酶活性僅為5 U/mL 左右 ；其他8 株菌株的蛋白酶活性均小于2 U/mL。菌株在不同培養(yǎng)基條件下酶活性不同，使用發(fā)酵培養(yǎng)基（底物酪蛋白為唯一氮源）后，15 株菌株的中性蛋白酶活性普遍有所提升，但菌株間蛋白酶活性的相對(duì)大小并未發(fā)生改變。

圖2 菌株在不同培養(yǎng)基條件下的蛋白酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of protease activity of strains under different medium conditions

2.2 不同菌種攜帶不同的胞外蛋白酶相關(guān)基因組合

通過(guò)對(duì)菌株全基因組上蛋白酶相關(guān)基因的篩查與統(tǒng)計(jì)，芽孢桿菌屬細(xì)菌攜帶有8 種胞外蛋白酶相關(guān)基因，包括aprE、aprX、nprE、epr、vpr、nprB、wprA和mpr。對(duì)上述基因的種類、轉(zhuǎn)錄方向、序列長(zhǎng)度和染色體組中相對(duì)位置進(jìn)行分析，可將其分為7 種基因型（G1～G7，圖3）。3 株B.subtiliis菌株N1282-4at、N1108-5at、N1303-2Ay 屬于G1 型，特點(diǎn)是染色體組上攜帶有上述8 種胞外蛋白酶基因。Bacillussp.A1、B.velezensisC1 屬于G2 型，染色體組上攜帶aprX、vpr、epr、mpr。B.altitudinisN435-3 屬于G3 型，相比G1 型缺少mpr、nprB和nprE。B.oceanisediminisN497-ZHONG 屬于G4 型，染色體組上攜帶aprX、vpr、nprB。B.megateriumN447-3、B.megateriumB1、B.aryabhattaiB2 屬于G5 型，染色體組上僅攜帶wprA、vpr，但同時(shí)存在2 個(gè)vpr。G6 型可分為3 個(gè)亞型G6.1、G6.2 和G6.3，其中B.cereusN435-1 屬于G6.1 型，菌株染色體組上攜帶vpr、nprB和mpr；BacillusN447-1屬于G6.2型，相比G6.1型缺少mpr；而B(niǎo)acillusN470-1 則屬于G6.3 型，染色體組上僅攜帶vpr。B.pseudomycoidesN451-2 屬于G7 型，染色體組上僅攜帶nprB。菌株Brevibacillus parabrevisB3 的染色體上則沒(méi)有攜帶上述8 種基因。

圖3 芽孢桿菌屬菌株蛋白酶的基因型分類結(jié)果F ig.3 Genotype classification results of Protease in Bacillus strains

通過(guò)與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有芽孢桿菌屬細(xì)菌的全基因組數(shù)據(jù)（截至2021 年11 月21 日）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)有173 株B.subtiliis具有全基因數(shù)據(jù)，其中159 株符合G1型基因分布（91.9%，159/173）；B.velezensis有97.6%（168/172）符合G2 型；B.altitudinis100%（22/22）符 合G3 型；沒(méi) 有B.oceanisediminis符合G4 型，考慮到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有2 株B.oceanisediminis的全基因組數(shù)據(jù)，因此存在較大偶然性；B.megaterium有87.5%（21/24）、B.aryabhattai有100%（2/2）符 合G5 型；而B(niǎo).cereus中僅有10.1%（8/79）符合G6.1 型，更多的是88.9%（70/79）符合G6.2 型，B.toyonensis100%（7/7）符 合G6.3 型；B.pseudomycoides100%（2/2）符合G7 型。

2.3 細(xì)菌蛋白酶基因分型與其進(jìn)化關(guān)系存在關(guān)聯(lián)

繪制基于細(xì)菌16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），15 株菌株（紅色）可分為Bacillus和Brevibacillus兩個(gè)屬，其中14 株屬于Bacillus，1 株屬于Brevibacillus。Bacillus屬可分為3 個(gè)分支，其中G1、G2、G3 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個(gè)分支（綠色），G4、G5 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個(gè)分支（黃色），G6、G7 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個(gè)分支（藍(lán)色）。B revibacillus parabreviB3 作為一個(gè)單獨(dú)的分支出現(xiàn)，表明其與其他細(xì)菌物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過(guò)與細(xì)菌的蛋白酶基因分型（圖3）進(jìn)行比對(duì)可發(fā)現(xiàn)，菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系越近，其染色體上攜帶的胞外蛋白酶基因種類越齊全。

圖4 基于細(xì)菌16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strains

2.4 芽孢桿菌蛋白酶基因分析

結(jié)合菌株的基因型分型結(jié)果（圖3）與產(chǎn)蛋白酶能力檢測(cè)結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，mpr、epr、vpr、nprB和wprA等5 個(gè)蛋白酶基因在產(chǎn)蛋白酶能力高和產(chǎn)酶能力低的菌株中均有攜帶情況。nprE基因僅有G1 型菌株攜帶，但其產(chǎn)酶能力低于不攜帶nprE的G2型。存在aprX和aprE的G1 型和G2 型菌株，其H/C 值和蛋白酶活性也均高于其他菌株，而也攜帶aprX和aprE的G3 型和攜帶aprX的G4 型菌株雖然其蛋白酶活性較低，但在酪蛋白瓊脂上的H/C 也是高于除G1 型和G2型菌株外的其他菌株。G1～G4 型菌株的共同特征是攜帶aprX或aprE基因，因此本研究將影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因初步確定為aprE和aprX。

2.5 不同菌種間蛋白酶基因aprX 表達(dá)差異顯著

為了探究影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因是否為aprX和aprE，本研 究檢測(cè)了B.velezensisC1、B.subtiliisN1282-4at、B.altitudinisN435-3、B.oceanisediminisN497-ZHONG在不同培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基）條件下aprX、aprE的mRNA 水平。在N B 培養(yǎng)基（圖5A，以B.subtiliisN1282-4at 作為對(duì)照），B.velezensisC1 的aprXm RNA 相對(duì)水平顯著高于其他3 株菌株，為B.subtiliisN1282-4at 的2.7倍左右；B.altitudinisN435-3 則僅為N1282-4at 的60%；而B(niǎo).oceanisediminisN497-ZHONG 則無(wú)表達(dá)或相比B.subtiliisN1282-4at 表達(dá)量過(guò)小。在發(fā) 酵培養(yǎng)基（圖5C），相比NB 培養(yǎng)基，B.velezensisC1 的aprXmRNA相對(duì)水平上升為B.subtiliisN1282-4at的3.6倍左右；B.altitudinisN435-3 也有所升高，為B.subtiliisN1282-4at 的80%；而B(niǎo).oceanisediminisN497-ZHONG 仍無(wú)表達(dá)或相比B.subtiliisN1282-4at 表達(dá)量過(guò)小。由圖 5B、圖5D 可見(jiàn)，發(fā)酵 培養(yǎng)基中B.altitudinisN435-3 的aprE相對(duì)表達(dá)水平為B.subtiliisN1282-4at 的約1.2 倍，差異顯著，其余差異均不顯著。根據(jù) 結(jié)果推測(cè)，aprX是影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因。

圖5 不同培養(yǎng)基菌株aprX 和aprE 的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of aprX and aprE under different medium conditions

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)15 株菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得了菌株的全基因組信息，并根據(jù)菌株染色體上攜帶的蛋白酶基因數(shù)量、種類、轉(zhuǎn)錄方向?qū)⑵浞譃? 種基因型，并進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。在15 株菌株中僅有G1 型的B.subtiliis擁有最全的8種蛋白酶基因，其他菌株都缺乏多種蛋白酶基因。通過(guò)對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株全基因組信息的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的相同菌種絕大多數(shù)歸為同一基因型，可以認(rèn)為在芽孢桿菌屬不同來(lái)源的相同菌種間，蛋白酶基因攜帶情況保守。

有研究指出，枯草芽孢桿菌的主要胞外蛋白酶分別是aprE編碼的枯草桿菌蛋白酶和nprE編碼的中性金屬蛋白酶［17-18］。但本研究結(jié)果顯示，僅G3 型菌株B.altitudinisN435-3 的aprEmRNA水平在發(fā)酵培養(yǎng)基條件下是G1 型菌株B.subtiliisN1282-4at 的約1.2 倍，其他情況差異不顯著。而nprE僅G1 型菌株攜帶，但缺乏nprE的G2 型菌株的產(chǎn)蛋白酶能力高于G1 型菌株?？赡苁且?yàn)镚1 型菌株的nprE表達(dá)水平過(guò)低使NprE 的活性沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)，同時(shí)aprE表達(dá)水平與G2 和G3 型細(xì)菌處于同一水平，而G2 型的aprX表達(dá)水平卻顯著高于G1 型菌株所致。

芽孢桿菌屬菌株通常在指數(shù)生長(zhǎng)期后期開(kāi)始大量產(chǎn)生胞外蛋白酶，這使得細(xì)菌可以高效利用外界的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而確保其正常的生長(zhǎng)發(fā)育［19］。控制芽孢桿菌胞外蛋白酶表達(dá)的調(diào)節(jié)途徑非常復(fù)雜，如AbrB、SinR 和ScoC 等調(diào)節(jié)因子可以抑制芽孢桿菌蛋白酶基因的表達(dá)，但Spo0A 可以抑制AbrB 和SinR 的活性從而促進(jìn)蛋白酶的產(chǎn)生［19］。此外，aprE和nprE還受到全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CodY 的強(qiáng)大且直接的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但由于CodY同時(shí)也抑制ScoC［20］，因此CodY 除了是aprE和nprE的直接負(fù)調(diào)節(jié)因子外，還通過(guò)抑制scoC的高水平表達(dá)充當(dāng)相同基因的間接正調(diào)節(jié)因子。由于CodY 和ScoC 都是aprE和nprE的強(qiáng)阻遏物，并且CodY 會(huì)在含有過(guò)量氨基酸的培養(yǎng)基中具有活性，但隨著氨基酸耗盡會(huì)失去活性［21］?？紤]到G1 型和G2 型菌株的進(jìn)化關(guān)系接近，這或許可以解釋為何G1 型細(xì)菌的產(chǎn)蛋白酶能力低于G2型細(xì)菌。本研究在細(xì)菌生長(zhǎng)的后期階段檢測(cè)了細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶的能力和基因的表達(dá)，而此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗導(dǎo)致CodY 的部分失活，從而減輕了對(duì)ScoC 的抑制，使ScoC 水平升高，持續(xù)抑制aprE和nprE的表達(dá)。因此結(jié)合熒光定量PCR 結(jié)果，aprE和nprE由于CodY 的失活導(dǎo)致對(duì)ScoC 抑制的減弱，從而受到ScoC 的強(qiáng)抑制，使細(xì)菌aprE和nprE的mRNA 水平降低。因此除aprE和nprE外，aprX是影響芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)胞外蛋白酶能力的又一重要基因。

蛋白酶是一種誘導(dǎo)酶，其在細(xì)菌內(nèi)部的生物合成受到多種因素誘導(dǎo)（如蛋白酶底物和底物類似物），同時(shí)也會(huì)受到細(xì)菌生存環(huán)境中易利用氮源（如氨基酸和銨鹽等）的阻遏［22-23］。因此，當(dāng)外界環(huán)境中存在大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，細(xì)菌只會(huì)產(chǎn)生少量蛋白酶來(lái)維持必要的生理活動(dòng)，只有在外界環(huán)境缺乏易利用氮源時(shí)，細(xì)菌才會(huì)大量產(chǎn)生蛋白酶，去獲取環(huán)境中其他難利用的大分子蛋白質(zhì)。這也解釋了為何細(xì)菌在發(fā)酵培養(yǎng)基（唯一氮源為酪蛋白）條件下aprX和aprE的表達(dá)水平比在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基條件下高。

4 結(jié)論

本研究對(duì)15 株芽孢桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序獲得了菌株的全基因組信息，并根據(jù)菌株攜帶的蛋白酶基因情況進(jìn)行了基因分型，通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株全基因組信息的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌不同來(lái)源的相同菌種間蛋白酶基因攜帶情況保守。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并與基因分型結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系越近，攜帶的胞外蛋白酶基因種類越齊全。通過(guò)對(duì)15 株芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶能力檢測(cè)，并進(jìn)行比較基因組學(xué)分析和qRT-PCR 驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)aprX是影響芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因。