畢天奇，肇英池，馬丹，程淑琴，王曉岑，李新，李建華，張西臣，宮鵬濤，張楠，張媛媛

1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062

雞球蟲病是一種寄生性原蟲?。?］，主要侵害雞腸道上皮細(xì)胞，分布廣泛，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的寄生蟲病之一［2］。目前，國(guó)際公認(rèn)危害雞的艾美耳球蟲有7 種，即柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）、堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）、毒害艾美耳球蟲（Eimeri anecateix）、巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima）、緩艾美耳球蟲（Eimeria mitis）、早熟艾美耳球蟲（Eimeria praecox）和布什艾美耳球蟲（Eimeria brunetti）［3］。堆型艾美耳球蟲主要影響肉用仔雞及后備母雞，導(dǎo)致母雞增重率及產(chǎn)蛋量下降［4］。以往對(duì)雞球蟲的防控主要依賴抗球蟲藥物和活疫苗［5］，但化學(xué)藥物的大量使用可導(dǎo)致藥物殘留，影響動(dòng)物源性食品安全，現(xiàn)已禁用部分抗球蟲藥物；而活疫苗毒力存在返強(qiáng)和散毒的風(fēng)險(xiǎn)［6］。因此，為促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)更加健康地發(fā)展，研制穩(wěn)定安全的抗球蟲疫苗十分必要。

近年，有研究已篩選出較多球蟲保護(hù)性基因，如SO7、cSZ1、NA4、TA4、AMA1等［7］，其中cSZ1基因具有高度的保守性，且cSZ1 蛋白免疫原性良好，是堆型艾美耳球蟲疫苗研究的候選蛋白［8］，但目前尚無畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)cSZ1基因的相關(guān)報(bào)道。本研究通過畢赤酵母表達(dá)堆型艾美耳球蟲cSZ1基因，制備了重組亞單位疫苗，并評(píng)價(jià)其免疫效果，以期為研制安全高效的堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗提供候選抗原。

1 材料與方法

1.1載體、菌株及蟲株 克隆載體pMD18-T 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；感受態(tài)畢赤酵母菌株GS115、酵母表達(dá)載體pPICZαA 及E.acervulina孢子化卵囊均由吉林大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)E.coliDH5α 購自沈陽天根生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶SacⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ、鼠源His 標(biāo)簽單克隆抗體、DNA T4 連接酶、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠及山羊抗雞IgG 均購自日本TaKaRa 公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker 及rTaq酶均購自沈陽天根生物技術(shù)有限公司；雞淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；大刀豆素（ConA）、CCK-8、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑均購自美國(guó)Sigma 公司；其他試劑均由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康海蘭褐雛雞，雄性，150 只，7 日齡，購自長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，均于無球蟲污染的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雛雞的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（文件號(hào)為：SY202007001）。

1.4目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 中登錄的cSZ1基因序列（AY513879.1），結(jié)合克隆載體pMD18-T 和酵母表達(dá)載體pPICZαA 多克隆位點(diǎn)序列，應(yīng)用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，cSZ1-F：5'-GAATTCATGGGTGAAGAGGCTGATACTCA-3'，cSZ1-R：5'-GTCGACTTAGAAGCCGCCCTGGTACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為513 bp。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以堆型艾美耳球蟲cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃60 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-cSZ1的構(gòu)建 膠回收目的基因片段，連接至克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coilDH5α 中，篩選陽性菌落，用DNA質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒。將酵母表達(dá)載體pPICZαA 和重組質(zhì)粒pMD18-T-cSZ1經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，回收載體片段及目的基因片段，以T4 DNA 連接酶于37 ℃連接過夜；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coilDH5α 中，挑取單克隆，進(jìn)行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送吉林省庫美生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZαA-cSZ1。

1.6重組菌GS115-pPICZαA-cSZ1的構(gòu)建 用SacⅠ酶線性化重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-cSZ1，無菌取線性化質(zhì)粒20 μL，加入感受態(tài)畢赤酵母菌株GS115 80 μL，混勻，冰浴15 min；電穿孔轉(zhuǎn)化，取90 μL，涂布于YPD 平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 ～3 d；出現(xiàn)白色菌落后，用酵母通用引物AOX1（上游：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGG-3'，下游：5'-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT-3'）進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)。陽性菌落送吉林省庫美生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組菌命名為GS115-pPICZαA-cSZ1。

1.7目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌GS115-pPICZαAcSZ1用6 mL YPD 液體培養(yǎng)基于30 ℃，200 r／min 培養(yǎng)16 h；加至50 mL BMGY 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)約12 h；菌液A600為5 時(shí)，2 000×g離心5 min；將菌體沉淀移至100 mL BMMY 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h 加入1 mL 甲醇，并取1 mL 菌液，2 000×g離心3 min，取上清，進(jìn)行10% SDS-PAGE 分析，直至144 h。取甲醇誘導(dǎo)120 h 的上清，經(jīng)10%SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；加入His 標(biāo)簽單克隆抗體（1 ∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗雞IgG（1 ∶5 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；H2SO4終止反應(yīng)，ECL 顯色。

1.8重組蛋白的大量制備及純化 將重組菌GS115-pPICZαA-cSZ1于BMMY 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h；收取上清液，2 000×g離心5 min，取上清，加入硫酸銨（472 g／L），4 ℃放置14 h；5 000×g離心30 min；取沉淀，用1 × PBS 重懸，飽和硫酸銨溶液透析；透析蛋白經(jīng)鎳柱純化，獲得純化蛋白cSZ1，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，-20 ℃保存。

1.9動(dòng)物分組及免疫 將150 只雛雞隨機(jī)分為5 組，每組30 只。其中3 個(gè)免疫組分別按20、40、60 μg ／ 只（低、中、高劑量）經(jīng)肌肉注射重組蛋白；7 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量及途徑同首次免疫。末次免疫7 d 后，經(jīng)口感染E.acervulina孢子化卵囊，劑量均為1 × 104個(gè)／ 只。同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組（未免疫，攻蟲劑量同免疫組）和陰性對(duì)照組（未免疫未攻蟲）。

1.10免疫效果評(píng)價(jià)

1.10.1臨床觀察 攻蟲后3 d 內(nèi)，觀察并記錄各組雛雞的飲食、精神狀態(tài)及糞便性狀等。

1.10.2抗球蟲效果 攻蟲后7 d，統(tǒng)計(jì)各組雛雞的存活情況，按下式計(jì)算存活率；稱量雛雞體重，按下式計(jì)算相對(duì)增重率。每組取3 只雛雞，解剖，觀察十二指腸組織，根據(jù)Johnson 計(jì)分方法統(tǒng)計(jì)各組雛雞的十二指腸病變計(jì)分［9］，計(jì)分總和即為病變值；麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)雛雞十二指腸組織中的卵囊數(shù)［3］，2 個(gè)計(jì)數(shù)室中卵囊數(shù)的平均值（單位為106個(gè)）乘以200，即為克糞便卵囊數(shù)（Oocysts per gramme，OPG），并換算為卵囊值，換算關(guān)系為：糞便排卵囊數(shù)（單位為106個(gè)）＜0.1、0.1 ～1.0、2.0 ～5.0、6.0 ～10.0、＞11.0 時(shí)對(duì)應(yīng)的卵囊值分別為0、1、10、20、40，按下式計(jì)算抗球蟲指數(shù)（anticoccidial index，ACI）。

1.10.3血清抗體水平檢測(cè) 采用間接ELISA 法。于初次免疫后7 d 及加強(qiáng)免疫后7 d，取低、中、高劑量免疫組和陰性對(duì)照組雛雞，每組3 只，經(jīng)心臟采血，分離血清。以制備的cSZ1 蛋白作為抗原包被96 孔板，1 μg ／孔，4 ℃包被過夜；PBST 洗滌3 次，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；PBST 洗滌3 次，加入待測(cè)血清（1 ∶2 000 稀釋），100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；PBST 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的兔抗雞IgG（1 ∶5 000 稀釋），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3 次，加入顯色液，50 μL ／ 孔，37 ℃避光孵育15 min；加入終止液，50 μL ／ 孔，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490。

1.10.4T 淋巴細(xì)胞增殖情況的檢測(cè) 攻蟲后7 d，取低、中、高劑量免疫組和陰性對(duì)照組雛雞，每組3只，無菌取脾臟，采用雞淋巴細(xì)胞分離試劑盒分離T淋巴細(xì)胞，通過CCK-8 法檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞增殖情況（A450）［5］。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1cSZ1基因PCR 產(chǎn)物的鑒定cSZ1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分析，可見513 bp 目的基因條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增序列與GenBank 中登錄的序列完全一致。

圖1 cSZ1 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of cSZ1 gene

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-cSZ1的鑒定 重組質(zhì)粒pPICZaA-cSZ1的雙酶切產(chǎn)物（EcoRⅠ／ SalⅠ）經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見3 593 和513 bp 的載體片段及目的基因片段，見圖2。測(cè)序結(jié)果顯示，堿基序列無突變和移碼。表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-cSZ1 雙酶切（EcoRⅠ／SalⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pPICZaAcSZ1（EcoRⅠ／SalⅠ）

2.3重組菌GS115-pPICZaA-cSZ1的鑒定 重組菌GS115-pPICZaA-cSZ1經(jīng)菌落PCR 鑒定，可見2 200（GS115）和1 093 bp（目的基因513 bp+載體580 bp）的基因條帶，見圖3。表明重組菌構(gòu)建正確。

圖3 重組菌GS115-pPICZaA-cSZ1 的菌落PCR 鑒定Fig.3 Identification of GS115-pPICZaA-cSZ1 by colony PCR

2.4重組蛋白的鑒定 甲醇誘導(dǎo)的陽性重組菌株GS115-pPICZaA-cSZ1經(jīng)10% SDS-PAGE 分析，均可見相對(duì)分子質(zhì)量約19 000 的目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，見圖4。誘導(dǎo)120 和144 h 的蛋白濃度較高，為節(jié)約誘導(dǎo)時(shí)間，選擇120 h 為誘導(dǎo)時(shí)間。甲醇誘導(dǎo)120 h 的蛋白可與鼠抗His 標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，于相對(duì)分子質(zhì)量約19 000 處可見特異性結(jié)合條帶，大小與理論值相符，且條帶清晰，無雜帶，見圖5，表明在畢赤酵母中成功表達(dá)重組蛋白cSZ1。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of recombinant protein

圖5 重組蛋白的Western blot 檢測(cè)Fig.5 Western blotting of recombinant protein

2.5免疫效果

2.5.1臨床表現(xiàn) 攻蟲后4 d，陽性對(duì)照組雛雞開始出現(xiàn)血便、稀便、羽毛逆立、精神萎靡等癥狀，其他各組雛雞偶有稀便，但食欲正常，均未出現(xiàn)死亡。

2.5.2抗球蟲效果 與陽性對(duì)照組比較，低、中、高劑量免疫組雛雞的相對(duì)增重率明顯升高（F分別為7.111、5.740、5.880，P均＜0.05），卵囊值明顯降低（F分別為63.593、54.795、61.780，P均＜0.01），十二指腸病變值顯著降低（F分別為10.286、12.250、5.444，P均＜0.05）。低劑量免疫組動(dòng)物的十二指腸病變值高于中、高劑量組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為0.400 和0.133，P均＞0.05）。經(jīng)計(jì)算，低、中、高劑量免疫組ACI 分別為171.25、176.42、174.33，保護(hù)效果較好，其中中劑量免疫組保護(hù)效果最好。見表1。

表1 重組亞單位疫苗的抗球蟲效果Tab.1 ACIs of recombinant subunit vaccine

2.5.3血清抗體水平 隨著免疫次數(shù)的增加，與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量免疫組雛雞于初次免疫后7 d 及加強(qiáng)免疫后7 d，血清抗體水平明顯升高（F= 1.522 ～13.00，P＜0.01），見圖6。

圖6 各組雛雞血清中的抗體水平Fig.6 Serum antibody levels of chicks in various groups

2.5.4T 淋巴細(xì)胞增殖情況 陰性對(duì)照組及低、中、高劑量免疫組雛雞T 淋巴細(xì)胞A450分別為0.291、0.487、0.522、0.507。與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量免疫組雛雞T 淋巴細(xì)胞增殖率顯著升高（F分別為4.342、2.594、8.025，P均＜0.01）。

3 討 論

堆型艾美耳球蟲是流行性最廣的雞球蟲之一［8］，雖然感染后不會(huì)導(dǎo)致大范圍的死亡，但嚴(yán)重影響感染雞的發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率及對(duì)其他疾病的抵抗力下降［9］。郭衍冰等［4］將構(gòu)建的重組卡介苗pMV361-cSZ1經(jīng)滴鼻免疫雞，發(fā)現(xiàn)卵囊產(chǎn)量下降62.7%，ACI高達(dá)182.93，呈較好的保護(hù)效果。本研究將cSZ1基因連接至酵母載體，獲得重組蛋白，經(jīng)肌肉注射免疫雞，結(jié)果表明，重組蛋白對(duì)免疫雞可產(chǎn)生較好的保護(hù)效果，但疫苗的免疫保護(hù)效果與注射劑量不呈劑量依賴性，該結(jié)果與文獻(xiàn)［10］的結(jié)論相符。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有高表達(dá)，安全無毒的特點(diǎn)，目前已有多種基因在其中得到高效表達(dá)［11-13］。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)還具有其他優(yōu)點(diǎn)：可穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白［14］；培養(yǎng)基所需成分單一，操作方便［15］；分泌上清表達(dá)，可對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行空間折疊和一定的糖基化修飾，更接近天然蛋白質(zhì)［16］。ZHANG等［17］將EtMIC2基因分別用畢赤酵母和E.coil進(jìn)行表達(dá)，用獲得的重組蛋白免疫雛雞，結(jié)果表明，免疫畢赤酵母表達(dá)的蛋白后，增重率、卵囊排出量、盲腸病變上明顯優(yōu)于E.coil表達(dá)蛋白組，特異性抗體水平和脾細(xì)胞增殖也高于E.coil表達(dá)蛋白組，表明畢赤酵母表達(dá)的重組蛋白EtMIC2 能夠誘導(dǎo)更高的體液免疫，提供更好的免疫保護(hù)力。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，用構(gòu)建的重組亞單位疫苗免疫雛雞后，體液和細(xì)胞免疫水平均顯著上升（P＜0.05），20、40 和60 μg 劑量免疫組的ACI 值分別為171.25、176.42、174.33，顯示了較好的免疫保護(hù)效果。

本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-cSZ1，于畢赤酵母中表達(dá)制備的重組亞單位疫苗經(jīng)不同劑量免疫雛雞，攻蟲試驗(yàn)均顯示良好的保護(hù)效果。本研究為堆型艾美耳球蟲疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。