陳耐寒，趙仁彬，孫鷖，李麗，鄭永欽，左榮霞，張進(jìn)萍，趙倩，沈濤，撒亞蓮

1.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院云南省第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心 云南省出生缺陷與遺傳病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南省臨床病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院國(guó)家臨床重點(diǎn)?？蒲嚎?，云南 昆明 650032；3.云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，免疫原性低，具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性［1-2］。近年來相繼從骨髓、脂肪、皮膚、外周血、牙髓、肌腱，以及新生兒附屬組織，如臍帶、胎盤、羊膜等組織中獲取MSCs，其中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）因來源充足，取材方便，且無明顯的倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，成為臨床細(xì)胞治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)［1-3］。

已有研究表明，MSCs 具有支持造血和免疫重建，以及在組織損傷修復(fù)與再生、自身免疫性疾病中有一定的治療作用［4］。目前在Clinicaltrials.gov 注冊(cè)的臨床試驗(yàn)針對(duì)的適應(yīng)癥主包括移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）、膝骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、狼瘡性腎炎、銀屑病、早發(fā)性卵巢功能不全、燒傷、脊髓損傷、心肌梗塞以及肝硬化等疾?。?-6］。古利明等［7］觀察到hUC-MSCs 聯(lián)合抗病毒等方法在控制新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）重癥患者的炎癥反應(yīng)和組織損傷中安全有效。然而，MSCs 的臨床療效與適應(yīng)癥、治療方案、不同研究者使用的MSCs 質(zhì)量等密切相關(guān)，其中，MSCs 的質(zhì)量屬性是比較分析不同研究者研究結(jié)果的基本要素。免疫調(diào)控能力是評(píng)價(jià)MSCs 生物學(xué)有效性最為相關(guān)的重要質(zhì)量屬性之一［8-9］，通過檢測(cè)MSCs 釋放免疫調(diào)控分子、抑制促炎性免疫細(xì)胞增殖或活性、促進(jìn)調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞增殖或極化的功能，以及MSCs 自身分泌不同類型免疫調(diào)控因子的能力等進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究通過檢測(cè)hUC-MSCs 對(duì)異體人PBMCs 增殖能力及其CD4+CD25+CD127dim／-調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）亞群分化能力的影響，探討hUC-hMSCs 的免疫調(diào)節(jié)特性，為建立MSCs制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)體系和提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及外周血 原代hUC-hMSCs 來自健康足月剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦提供的新生兒臍帶，孕婦均簽署知情同意書。提供；健康體檢人群外周血由昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院提供。本研究獲得昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，樣本捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 淋巴細(xì)胞分離液（LSM-200）購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）（20200108）購自廣州達(dá)暉生物技術(shù)服務(wù)有限公司；胎牛血清（1932595）購自美國(guó)Gibco 公司；低糖DMEM 培養(yǎng)基（AD17218269）、RPMI1640 培養(yǎng)基（0024318）購自美國(guó)Hyclone 公司；DPBS（0034819）、MSCs Nutri-Stem XF Medium（2008115）購自以色列BI 公司；鼠抗人單克隆抗體CD3（Z6410001）、CD4（Z6410005）、CD25（Z6410045-100T）、CD127（Z6410052-100T）購自北京同生時(shí)代生物技術(shù)有限公司；hUC-MSCs 成骨（CHEM-200008）、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（CHEM-200007）購自上海麒盟生物醫(yī)藥有限公司；hUCMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒（HUXUC-90041）購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司；全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀BC-5100 購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；流式細(xì)胞儀購自安捷倫科技有限公司。

1.3hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)及成脂、成骨、成軟骨樣細(xì)胞分化潛能的鑒定 參考文獻(xiàn)［10］。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代hUC-MSCs，經(jīng)酶消化法傳代培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞，獲得第4 代hUC-MSCs，按每孔3 × 105個(gè)接種6 孔板，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，待細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。成軟骨誘導(dǎo)分化：將3 ×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，250×g離心4 min，棄上清，預(yù)混液洗滌2 次，加入誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞團(tuán)，150 ×g離心5 min，不棄上清，直接將離心管置37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 ～48 h；當(dāng)細(xì)胞團(tuán)聚攏成小球時(shí)，輕彈離心管底部，使小球懸浮在液體中，隨后每隔2 ～3 d 更換誘導(dǎo)完全培養(yǎng)液，其間觀察誘導(dǎo)液和小球變化。待成脂、成骨、成軟骨持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)23 d 后終止誘導(dǎo)，棄上清，PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定，成脂、成骨樣細(xì)胞固定20 min 后，油紅O 染色鑒定是否為脂肪樣細(xì)胞，茜素紅染色鑒定是否有成骨細(xì)胞產(chǎn)生的鈣鹽沉積；離心管底的軟骨球固定1 h 后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋切片、阿利新藍(lán)染色，確定是否有軟骨細(xì)胞特征性成分酸性黏多糖存在。

1.4人PBMCs 的分離 采用Ficoll 密度梯度離心法。向EDTA 抗凝管里添加等量PBS，充分混勻，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液面上，500 ×g離心20 min；取乳白色中間層細(xì)胞懸液至新的離心管中，PBS 洗滌細(xì)胞，300 ×g離心5 min；棄上清，PBS 洗滌細(xì)胞，采用全自動(dòng)血液分析儀計(jì)數(shù)后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 109個(gè)／ L，備用。

1.5hUC-MSCs 與異體PBMCs 的共培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)［11-12］。試驗(yàn)分PBMCs 單獨(dú)培養(yǎng)組（對(duì)照組）及hUC-MSCs 與PBMCs 共培養(yǎng)組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。為去除hUC-MSCs 的增殖能力，保留其分泌生物活性物質(zhì)的能力，用30 Gy 的60Co γ 射線照射預(yù)處理hUCMSCs。將hUC-MSCs 按3 × 104個(gè)／ 孔接種24 孔板，分別按1 ∶5 和1 ∶10 的比例與PBMCs 共培養(yǎng)，依次加入25 mg ／ L PHA，將培養(yǎng)板進(jìn)行8 字形混勻后，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d；采用全自動(dòng)血液分析儀計(jì)數(shù)活化PBMCs 的數(shù)量。

1.6hUC-MSCs 對(duì)異體PBMCs 免疫調(diào)節(jié)作用的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，300 ×g離心5 min，棄上清，用含0.1%BSA 的PBS 洗滌細(xì)胞1 次，用100 μL 含0.1% BSA的PBS 重懸細(xì)胞沉淀，加入鼠抗人單克隆抗體CD3-PECY7、CD4-FITC、CD25-APC 和CD127-PE，4 ℃避光孵育30 min；用含0.1% BSA 的PBS 洗滌細(xì)胞1 次，用400 μL 含0.10% BSA 的PBS 重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細(xì)胞百分比。按下式計(jì)算hUC-MSCs 對(duì)PBMCs 增殖抑制率。

2 結(jié) 果

2.1hUC-MSCs 的培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見，hUC-MSCs 為貼壁生長(zhǎng)的梭形樣細(xì)胞，見圖1A；hUC-MSCs 在向成脂肪樣細(xì)胞分化過程中，細(xì)胞形態(tài)從變?yōu)閳A形或多邊形逐漸到胞質(zhì)內(nèi)有小空泡樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，胞質(zhì)內(nèi)的小空泡樣結(jié)構(gòu)增多，并互相融合成“葡萄串”，油紅O 染色顯示胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色成熟脂滴沉積，見圖1B；茜素紅染色后呈紫紅色，表明hUC-MSCs 分化為成骨樣細(xì)胞，有鈣鹽形成并沉積，見圖1C；阿利新藍(lán)將軟骨小球中分化細(xì)胞染為藍(lán)色，表明hUC-MSCs 分化為成軟骨樣細(xì)胞，見圖1D，在hUC-MSCs 向成軟骨樣細(xì)胞分化過程中有硫酸軟骨素和氨基聚糖等酸性黏多糖產(chǎn)生。

圖1 hUC-MSCs 的形態(tài)觀察及鑒定Fig.1 Morphological observation and identification of hUCMSCs

2.2hUC-MSCs 對(duì)異體PBMCs 增殖的抑制作用 倒置顯微鏡下觀察可見，PBMCs 呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞為圓形或橢圓形，折光性好，形態(tài)大小較為一致，在PHA作用48 h 后，細(xì)胞體積變大，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，聚團(tuán)細(xì)胞增多，細(xì)胞團(tuán)增大，呈聚團(tuán)和／ 或散在分布，見圖2A；單獨(dú)培養(yǎng)組懸浮細(xì)胞數(shù)量明顯多于共培養(yǎng)組，見圖2B。hUC-MSCs 與PBMCs以1 ∶5 和1 ∶10 比例共培養(yǎng)5 d，hUC-MSCs 抑制PBMCs 增殖率分別為（81.54 ± 5.10）%和（43.37 ±3.35）%，高于單獨(dú)培養(yǎng)組。

圖2 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)中細(xì)胞Fig.2 Inverted microscopy of cells in culture

2.3hUC-MSCs 對(duì)PBMCs 中Treg 細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用 hUC-MSCs 與PBMCs 以1 ∶5 和1 ∶10 比例共培養(yǎng)5 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，共培養(yǎng)組中CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細(xì)胞亞群百分比分別為（3.64 ± 0.49）%和（2.61 ± 0.26）%，見圖3。與對(duì)照組［（2.11 ± 0.14）%］比較，hUC-MSCs 促進(jìn)Treg細(xì)胞亞群增殖，上調(diào)效率分別為（41.73 ± 4.66）%和（19.39 ± 5.62）%。

圖3 CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細(xì)胞亞群流式圖Fig.3 Flow cytometry of CD4+CD25+CD127dim／-Treg cell subsets

3 討 論

MSCs 是存在于多種組織器官間質(zhì)中的一類成體干細(xì)胞，主要通過組織塊貼壁法、酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)酶消化法傳代擴(kuò)增、純化細(xì)胞［10，13］。目前主要從3 個(gè)方面進(jìn)行MSCs 的鑒別［14］，即形態(tài)學(xué)觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，梭形，似成纖維細(xì)胞；細(xì)胞表型為CD73、CD90 與CD105 陽性細(xì)胞百分比≥95.0%，而CD34、CD45、HLA-DR、CD14 或CD11b、CD79a 或CD19 的陰性細(xì)胞百分比≤2.0%；MSCs 具有成脂、成骨以及成軟骨的分化潛能。本研究采用前期課題組建立的組織塊貼壁培養(yǎng)法獲取的hUC-MSCs（已完成hUC-MSCs 表型鑒定［10］），觀察到hUC-MSCs 具有分化為成脂肪樣細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞和成軟骨樣細(xì)胞的潛能，提示本研究平臺(tái)制備的hUC-MSCs 符合國(guó)際干細(xì)胞協(xié)會(huì)制定的鑒定標(biāo)準(zhǔn)［10，14］。

MSCs 具有向受損組織器官歸巢，通過自分泌和／或旁分泌改善局部微環(huán)境，以及多向分化潛能和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性等特點(diǎn)，使其在臨床細(xì)胞治療研究中發(fā)揮著重要作用［2，5-6］。MSCs 制劑的臨床安全性和有效性受其質(zhì)量屬性的影響，其中免疫調(diào)節(jié)特性是評(píng)價(jià)MSCs 臨床療效最為相關(guān)的重要質(zhì)量屬性之一［8-9］。本研究將hUC-MSCs 與PBMCs 以1 ∶5 和1 ∶10 的比例共培養(yǎng)5 d，采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)活化PBMCs 數(shù)量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細(xì)胞亞群百分比，觀察到hUC-MSCs抑制異體PBMCs 增殖，而促進(jìn)Treg 細(xì)胞亞群分化，其作用強(qiáng)度與hUC-MSCs 數(shù)量成正比，即有劑量依賴性；與韓曉燕等［9］、劉夢(mèng)婷［12］等、POLTAVTSEV等［15］報(bào)道一致。以上結(jié)果提示，hUC-MSCs 發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。

已有的研究表明，MSCs 抑制活化PBMCs 增殖作用不受刺激淋巴細(xì)胞活化因子類型的影響［12，15-16］。刺激淋巴細(xì)胞活化的因子有PHA、刀豆蛋白A、葡萄球菌A 蛋白、美洲商陸有絲分裂原、CD2 mAb、CD3 mAb 和IL-2 等非特異性免疫刺激劑，以及特異性抗原，其中應(yīng)用較為廣泛的是PHA。POLTAVTSEV等［15］觀察到hUC-MSCs 抑制PHA 活化的PBMCs，Transwell 間接培養(yǎng)使MSCs 對(duì)PBMCs 增殖的抑制作用顯著降低。TSE 等［16］用CD3 nAb 和CD28 CD3 nAb 刺激PBMCs，與人骨髓MSCs 共培養(yǎng)7 d 后，用3H-胸腺嘧啶核苷摻入法檢測(cè)活化PBMCs 的增殖情況，結(jié)果顯示，MSCs 顯著抑制了PBMCs 增殖。本課題組已報(bào)道MSCs 抑制CD3-mAb 聯(lián)合IL-2、IFNγ 等活化的DC-CIK 細(xì)胞增殖以及TNF-α 等細(xì)胞因子的釋放［17］。在hUC-MSCs 與PBMCs 共培養(yǎng)體系中，預(yù)處理MSCs 的培養(yǎng)體系類似單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，其預(yù)處理方法常用的有細(xì)胞周期非特異性抑制劑絲裂霉素C 或60Co γ 射線照射［11-12，18-19］，目的是抑制其增殖而保留分泌生物活性物質(zhì)的能力；如果不對(duì)MSCs 進(jìn)行預(yù)處理，其培養(yǎng)體系類似雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。已有研究表明，MSCs 抑制異體PBMCs增殖的能力不受MSCs 是否接收預(yù)處理的影響，均可觀察到MSCs 有抑制PBMCs 增殖的能力［12，17-18，20］。

PBMCs 包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，以T 淋巴細(xì)胞為主。獲取PBMCs 的常用方法是密度為1.077 ±0.002 2 的Ficoll-Hypaque（聚蔗糖-泛影葡胺，也稱淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法［12，17］，但獲得的PBMCs 中會(huì)混雜有約10%的其他血細(xì)胞。為獲取純度高的T 淋巴細(xì)胞，可選用免疫磁珠、流式分選、親和板結(jié)合分離、脫脂棉柱與尼龍棉柱等方法［21-22］，但面臨費(fèi)用、技術(shù)平臺(tái)等因素的限制。另外，當(dāng)前由于國(guó)家法律法規(guī)對(duì)血源的管理，限制了實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定大量獲取健康個(gè)體人群PBMCs 的來源，對(duì)于評(píng)價(jià)不同批次、相同批次不同代次MSCs 的免疫調(diào)節(jié)能力時(shí)，面臨結(jié)果重復(fù)性、可比性差的問題；因此有必要考慮建立健康人群永生化免疫細(xì)胞庫的問題。

Treg 細(xì)胞是T 細(xì)胞的一個(gè)重要亞群，對(duì)維持機(jī)體免疫動(dòng)態(tài)平衡具有重要作用，其數(shù)量的增加和／或功能異?？蓪?dǎo)致自身免疫性疾病［23］。Treg 細(xì)胞亞群是CD4 陽性細(xì)胞中的一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其細(xì)胞膜表面高表達(dá)CD25 是其主要特點(diǎn)之一。目前用于檢測(cè)Treg 細(xì)胞的標(biāo)記物組合主要有CD4+CD25+CD127dim／-與CD4+CD25+FOXP3+；CD127 為IL-7α鏈?zhǔn)荏w，在CD4+CD25+Treg 細(xì)胞中的表達(dá)呈持續(xù)性低水平；而Foxp3 為轉(zhuǎn)錄抑制因子，需要進(jìn)行破膜后檢測(cè)［23-24］。因此，本研究選用檢測(cè)Treg 細(xì)胞亞群的方案為CD4+CD25+CD127dim／-，在體外觀察到hUCMSCs 促進(jìn)Treg 細(xì)胞分化，提示其發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)特性。已有研究表明，MSCs 通過分泌生物活性物質(zhì)影響不同類型免疫細(xì)胞的增殖分化，大部分哺乳動(dòng)物來源的MSCs 分泌IDO 為主的免疫負(fù)調(diào)節(jié)分子，而小鼠來源的MSCs 以上調(diào)NO 為主發(fā)揮抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用［25］。MSCs 的生物學(xué)特性受微環(huán)境的調(diào)節(jié)，MSCs 發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用還是免疫調(diào)節(jié)作用由微環(huán)境中炎癥介質(zhì)的種類和濃度決定［4，10］。即MSCs 免疫原性具有可塑性，其表型可極化為MSC1 和MSC2［4，25-26］。MSC1 為促炎表型，MSC2 具有免疫抑制特性。但靜息狀態(tài)的MSCs 為免疫原性較弱的細(xì)胞，不表達(dá)或低表達(dá)HLA-DR、CD40、CD80 及CD86等T 細(xì)胞活化需要的第二信號(hào)分子。然而，在急性炎癥反應(yīng)微環(huán)境中有高濃度的TNF-α、IFNγ 等炎性因子存在，或TLR3 激活劑作用下，MSCs 極化為抗炎的MSC2，有利于促進(jìn)組織的損傷修復(fù)。另一方面，在IL-10、TGF-β 等抗炎因子存在，或TLR4 低劑量，短時(shí)間的刺激下，靜息狀態(tài)的MSCs 極化為促炎的MSC1，有利于啟動(dòng)組織損傷早期的免疫應(yīng)答。鑒于此，MSCs 是在炎癥微環(huán)境“授權(quán)”后激活免疫調(diào)節(jié)特性。但是MSCs 表型極化的分子機(jī)制尚不十分清楚，加之機(jī)體內(nèi)病理微環(huán)境存在時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，這無疑為制定MSCs 治療方案、療效評(píng)價(jià)增加了復(fù)雜性，提示MSCs 的臨床應(yīng)用工作仍任道重遠(yuǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)，hUC-MSCs 在體外抑制PBMCs 增殖及促進(jìn)CD4+CD25+CD127dim／-Treg 細(xì)胞亞群表達(dá)上調(diào)，揭示hUC-MSCs 在體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。通過檢測(cè)hUCMSCs 抑制活化PBMCs 增殖、促進(jìn)Treg 細(xì)胞亞群增殖的能力可作為評(píng)價(jià)hUC-MSCs 生物學(xué)有效性的指標(biāo)之一。