廖輝，吳瓊，焦龍，甄祖剛，楊文腰，周荔葆

遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽 110179

狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒引起的人畜共患性傳染病，全球每年死于狂犬病的人數(shù)約5.9 萬，是致死人數(shù)較多且威脅公共衛(wèi)生的動物源性傳染病［1］。接種狂犬病疫苗是防治人患狂犬病唯一有效的方法。我國每年狂犬病疫苗接種量可達(dá)1 500 萬人份［2］。

目前，國內(nèi)人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株主要包括CTN-1V、aG 和PV2061 株［3］。人用狂犬病疫苗（二倍體細(xì)胞）（human diploid cell vaccine，HDCV）是由法國巴斯德研究所首次報道，具有較好的免疫原性和安全性［4］。本文旨在研究狂犬病病毒固定株P(guān)V2061 在人二倍體MRC-5 細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代，觀察不同代次病毒感染特性，比較不同稀釋度下病毒的病毒滴度和收獲時間，確定最佳傳代工藝，通過對病毒液純化工藝的優(yōu)化，為疫苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1毒種及細(xì)胞 狂犬病病毒固定株P(guān)V2061 來源于本公司Vero 細(xì)胞適應(yīng)株，原始毒株由美國CDC提供；MRC-5 細(xì)胞由ATCC 提供。

1.2實驗動物 SPF 級昆明小鼠，3 周齡，雌雄各半，體重11 ~ 13 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號：43004700008361。本實驗均以科研為目的對實驗動物進行養(yǎng)殖和使用，且按照2006 年9 月13 日科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中動物倫理相關(guān)規(guī)定進行（國科發(fā)財字［2006］398 號）。

1.3主要試劑及儀器 L-15 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；新生牛血清購自蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司；狂犬病病毒抗原含量檢測用熒光抗體購自NIBSC，自行包被；牛血清殘留量檢測試劑盒購自無錫博生醫(yī)用生物公司；層析系統(tǒng)購自美國GE 公司；超濾系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司。

1.4狂犬病病毒在人二倍體細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代將狂犬病病毒固定株P(guān)V2061 以1 ∶1 000 稀釋度感染MRC-5 細(xì)胞進行連續(xù)性傳代。感染后于37 ℃培養(yǎng)3 ～4 d，待細(xì)胞基本鋪滿平面后更換病毒培養(yǎng)液，于35 ℃培養(yǎng)，每隔3 ～4 d 換液1 次，細(xì)胞病變率達(dá)80%以上收獲，為1 代。按上述相同方式從第2 代（MPV2）連續(xù)傳至第24 代（MPV24），取樣檢測病毒滴度。

1.5感染劑量（MOI）對病毒增殖影響的檢測 取第11 代狂犬病病毒懸液，分別按1 ∶100、1 ∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500 MOI 接種于MRC-5 細(xì)胞，考察不同MOI 對病毒增殖的影響。感染后于37 ℃培養(yǎng)3 d，更換病毒培養(yǎng)液，于35 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 ～4 d 換液1 次，細(xì)胞病變率達(dá)80%以上收獲。取樣檢測3 批收獲液的病毒滴度。試驗重復(fù)2 次。

1.6不同收獲天數(shù)對病毒增殖影響的檢測 取第11 代狂犬病病毒懸液，接種于MRC-5 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)3 d，更換病毒培養(yǎng)液，35 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別取4、7、10、13、16 d 的病毒培養(yǎng)物，檢測病毒滴度。對不同天數(shù)病毒培養(yǎng)物進行熒光染色，觀察熒光反應(yīng)。

1.7感染方式對病毒增殖影響的檢測 取第11 代狂犬病病毒懸液，分別考察混種感染、吸附感染及帶毒傳代3 種感染方式對病毒增殖的影響。選擇第26 代MRC-5 細(xì)胞，混種感染方式同1.4 項；吸附感染：待細(xì)胞鋪滿單層后，吸附病毒，于37 ℃放置1 h，再加入病毒培養(yǎng)液，于35 ℃培養(yǎng)，每隔3 ～4 d換液1 次，細(xì)胞病變率達(dá)80%以上收獲；帶毒傳代：在混種感染基礎(chǔ)上于37 ℃培養(yǎng)3 d 后再次進行細(xì)胞1 ∶2 或1 ∶4 傳代，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d，更換病毒培養(yǎng)液，于35 ℃培養(yǎng)，每隔3 ～4 d 換液1 次，細(xì)胞病變率達(dá)80%以上收獲。取樣檢測3 批收獲液的病毒滴度。試驗重復(fù)2 次。

1.8不同層析介質(zhì)對狂犬病病毒純化效果影響的檢測 取3 批狂犬病病毒收獲液（20141001-1、2014-1003-2、20141201-3），經(jīng)超濾濃縮、滅活等后，分別用層析介質(zhì)Sepharose 4FF 和Sepharose 6FF 進行柱層析純化，上樣量不超過柱床體積的15%，在280 nm下收集樣品，檢測抗原含量、總蛋白質(zhì)及牛血清白蛋白殘留量，分析不同層析介質(zhì)對狂犬病病毒收獲液純化效果的影響。

1.9病毒滴度檢測 按照《中國藥典》三部（2010版）病毒滴度檢測方法進行。選擇10-3、10-4、10-53個稀釋度經(jīng)腦內(nèi)接種小鼠，每個稀釋度接種6 只，0.3 mL ／ 只。逐日觀察，3 d 內(nèi)死亡者不計（死亡數(shù)量應(yīng)不超過試驗動物總數(shù)的20%），觀察14 d。病毒滴度應(yīng)不低于6.0 lgLD50／ mL。

1.10抗原含量及回收率測定 采用ELISA 試劑盒檢測狂犬病病毒抗原含量，在波長492 nm 處測定吸光度值。根據(jù)柱層析前后總抗原含量的比值計算回收率。

1.11總蛋白質(zhì)含量檢測 采用Lowry 法。按照《中國藥典三部（2010 版）蛋白質(zhì)含量檢測方法進行，在波長650 nm 處測定吸光度值。

1.12牛血清白蛋白殘留量檢測 采用定量牛血清白蛋白ELISA 試劑盒，于波長450 nm 處測定吸光度值?？袢〔《炯兓褐信Ｑ灏椎鞍讱埩袅繎?yīng)不高于50 ng ／ mL。

2 結(jié) 果

2.1狂犬病病毒固定株P(guān)V2061 在MRC-5 細(xì)胞上連續(xù)性傳代的適應(yīng)性 狂犬病病毒固定株P(guān)V2061對MRC-5 細(xì)胞有較好的適應(yīng)性，初始病毒滴度為5.28 lgLD50／ mL。從第4 代開始，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒滴度液逐漸升高，在第11 ～19 代之間病毒滴度達(dá)6.50 lgLD50／ mL 以上，穩(wěn)定在6.50 ～7.50 lgLD50／ mL 之間，表明該固定株已完全適應(yīng)于MRC-5 細(xì)胞。見表1。

表1 狂犬病病毒固定株P(guān)V2061 在MRC-5 細(xì)胞上連續(xù)性傳代的病毒滴度（lgLD50／ mL）Tab.1 Virus titers of rabies virus fixed strain PV2061 subcultured continuously in MRC-5 cells（lgLD50／ mL）

2.2MOI 對病毒增殖的影響 1 ∶100、1 ∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500 MOI 的狂犬病病毒固定株P(guān)V2061 感染MRC-5 細(xì)胞后，病毒滴度均值分別為6.64、6.60、6.40、6.52 和6.60 lgLD50／ mL，均高于6.20 lgLD50／ mL，且3 個批次間差異較小。表明感染劑量在1 ∶100 ～1 ∶500 之間病毒增殖無明顯差異。見表2。

表2 不同MOI 下的病毒滴度（lgLD50／ mL）Tab.2 Titers of virus inoculated at various MOIs（lgLD50／ mL）

2.3不同收獲天數(shù)對病毒增殖的影響 4、7、10、13、16 d 病毒培養(yǎng)物的滴度分別為2.69、6.14、6.52、7.02 和3.62 lgLD50／ mL，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，病毒滴度呈上升趨勢，在第13 天達(dá)峰值，然后急劇下降。熒光染色結(jié)果顯示，從第4 天開始，細(xì)胞逐漸產(chǎn)生病變，熒光反應(yīng)也逐漸增強，尤其在7 ～16 d 之間，見圖1，與病毒滴度檢測結(jié)果基本相符。

圖1 不同收獲天數(shù)病毒培養(yǎng)物的熒光染色結(jié)果（× 200）Fig.1 Fluorescence staining of virus cultures harvested on different days after inoculation（× 200）

2.4感染方式對病毒增殖的影響 吸附感染3 批收獲液病毒滴度均值分別為4.28、5.15 和5.12 lgLD50／mL，混種感染3 批收獲液病毒滴度均值分別為6.44、5.63 和5.87 lgLD50／ mL，帶毒傳代3 批收獲液病毒滴度均值分別為5.97、6.77 和5.73 lgLD50／ mL，不同批次間差異較小，表明混種感染和帶毒傳代對狂犬病病毒增殖優(yōu)于吸附感染。見表3。

表3 不同感染方式下收獲液的病毒滴度（lgLD50／ mL）Tab.3 Titers of harvested virus fluids infected by different modes（lgLD50／ mL）

2.5不同層析介質(zhì)對狂犬病病毒純化效果的影響層析介質(zhì)Sepharose 4FF 和Sepharose 6FF 純化的3批抗原平均回收率分別為85.68%和87.37%，均在85%～120%范圍內(nèi)；總蛋白質(zhì)去除率分別為88.76%和80.89%，Sepharose 4FF 明顯優(yōu)于Sepharose 6FF；牛血清白蛋白殘留量均低于50 ng ／ mL。見表4。

表4 不同層析介質(zhì)純化后3 批狂犬病病毒抗原回收率、總蛋白質(zhì)及牛血清白蛋白去除效果Tab.4 Antigen recoveries as well as removal rates of total protein and BSA of three batches of rabies virus purified with different chromatographic media

3 討 論

目前國內(nèi)已授權(quán)上市的狂犬病疫苗主要為雞胚細(xì)胞狂犬病疫苗［5］、Vero 細(xì)胞狂犬病疫苗［6-7］、倉鼠腎細(xì)胞狂犬病疫苗［8］和HDCV［9］。但狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞）總不良反應(yīng)發(fā)生率為30.5%，高于HDCV的1.5%，尤其對于孕婦和嬰幼兒來說，選擇更具有安全性和有效性的狂犬病疫苗十分重要［10］。FAYAZ等［11］對注射了5 針HDCV 的26 人進行跟蹤研究，在32 年后隨訪時發(fā)現(xiàn)，絕大部分人中和抗體水平仍有保護性，加強免疫注射后，中和抗體水平在2.6 ～20 IU ／ mL 之間。

影響狂犬病疫苗接種后效果的因素很多，其中最主要的是疫苗效價。影響疫苗效價的因素包括毒株對宿主細(xì)胞的適應(yīng)性、生產(chǎn)時宿主細(xì)胞狀態(tài)、病毒MOI、病毒接種時間、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)溫度等，而毒株對宿主細(xì)胞的適應(yīng)性是影響病毒產(chǎn)量的重要因素之一。因此，對毒株的篩選及適應(yīng)性傳代對整個疫苗工藝來說至關(guān)重要。

選擇MRC-5 細(xì)胞為狂犬病病毒固定株P(guān)V2601的宿主載體，經(jīng)連續(xù)性傳代后，獲得培養(yǎng)特征明顯、穩(wěn)定的細(xì)胞適應(yīng)株（MPV2061），第11 ～19 代病毒滴度均在6.20 lgLD50／ mL 以上，通過對MOI、感染方式和培養(yǎng)天數(shù)的優(yōu)化初步建立了MPV 株在MRC-5 細(xì)胞上的培養(yǎng)條件，對收獲及純化工藝的研究為狂犬病疫苗生產(chǎn)提供了試驗數(shù)據(jù)。

固定株P(guān)V2061 在MRC-5 細(xì)胞上適應(yīng)性傳代過程中，初步評估了MOI 和收獲天數(shù)對病毒增殖的影響，結(jié)果表明，MOI 在1 ∶100 ～1 ∶500 范圍內(nèi)，病毒滴度均值均高于6.0 lg LD50／ mL；收獲天數(shù)在10 ～13 d，病毒滴度均高于6.5 lg LD50／ mL，在第13 天達(dá)峰值，然后急劇下降至3.62 lgLD50／ mL。

病毒培養(yǎng)條件研究主要對感染方式和收獲方式進行了初步探討。對比發(fā)現(xiàn)，混種感染（6.44 ／5.63 ／ 5.87 lgLD50／ mL）和帶毒傳代（5.97 ／ 6.77 ／5.73 lgLD50／ mL）有利于病毒在細(xì)胞體內(nèi)增殖，病毒滴度明顯高于吸附感染（4.28／5.15／5.12 lgLD50／mL）。分批收獲從第7 天開始，分別于7、10、13 d 共計收獲3 次，第4 次收獲液病毒滴度無法檢測，均值為6.10 lgLD50／ mL，而連續(xù)收獲能收獲16 d，第7 ～9天，病毒滴度檢測均較低，第10 ～16 天，收獲液病毒滴度均高于5.0 lgLD50／mL，均值為5.30 lgLD50／mL。

綜上所述，本研究采用Vero 細(xì)胞適應(yīng)株P(guān)V2061在MRC-5 細(xì)胞上進行連續(xù)性傳代，優(yōu)化了MOI、感染方式及收獲天數(shù)等培養(yǎng)條件，以及感染后收獲方式。結(jié)果表明，獲得的狂犬病病毒二倍體細(xì)胞適應(yīng)株MPV2061 檢測結(jié)果符合《中國藥典》三部（2010版）要求，為后續(xù)人用狂犬病疫苗（人二倍體細(xì)胞）的研發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。