李德珍，馮翎，余洛瀟，常國棟

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430060；2.湖北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430000

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，占20 歲以下人群骨癌的56%［1］?；瘜W(xué)療法和手術(shù)治療使骨肉瘤患者的5 年總生存率從10%提高至70%，但對于有轉(zhuǎn)移或存在耐藥性的病例，預(yù)后仍較差［2］。因此，迫切需要尋找骨肉瘤的新治療策略。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類內(nèi)源性RNA，由無5'→3'極性的閉環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起，通過充當(dāng)microRNA 來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因的表達［3］。有報道表明，許多circRNA 可作為癌癥診斷和治療的標(biāo)志物，包括肝癌、胃癌和肺腺癌等［4-6］。目前，尚無有關(guān)骨肉瘤與circRNAhsa_circ_0004771相關(guān)性的研究，本研究旨在探究circRNAhsa_circ_0004771基因干擾對骨肉瘤細胞生長及凋亡的影響，為骨肉瘤新治療策略的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞及干擾序列 人成骨肉瘤MG63 細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；3 對hsa_circ_0004771基因干擾序列（shRNA1 ～3）及陰性對照序列（shRNANC）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（10082-147）、胰蛋白酶及青-鏈霉素均購自美國Gibco 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1、EdU 細胞增殖檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Hoechst 雙染試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3、c-Myc、β-actin 單克隆抗體均購自英國Abcam 公司。

1.3細胞培養(yǎng) 將MG63 細胞用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素）于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 更換1 次培養(yǎng)液。

1.4shRNA 干擾效果的檢測 取對數(shù)生長期的MG63 細胞，用LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑將hsa_circ_000-4771shRNA1、shRNA2、shRNA3 及shRNA-NC 序列分別轉(zhuǎn)染至MG63 細胞，同時設(shè)空白對照組（不轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染后72 h，Trizol 試劑提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，共35 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT法計算各目的基因相對表達量。

1.5hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞EdU陽性細胞數(shù)影響的檢測 按1.4 項方法將MG63細胞分為shRNA 組（選擇干擾效果最佳的干擾序列）、shRNA-NC 組及空白對照組。取對數(shù)生長期的各組MG63 細胞，按每孔1×105個接種于96 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜；加入含50 μmol ／ L EdU 的DMEM 培養(yǎng)基，100 μL ／ 孔，37 ℃孵育2 h；PBS 洗滌2 次，每次5 min，加入4%多聚甲醛，室溫孵育30 min；加入2 mg／mL 甘氨酸，繼續(xù)孵育5 min；加入0.5%TritonX-100 滲透液，繼續(xù)孵育10 min；加入Apollp 染液，避光30 min；加入Hoechst 33342，室溫孵育2 min；PBS洗滌2 次，每次5 min。置熒光顯微鏡下觀察。

1.6hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞凋亡率影響的檢測

1.6.1流式細胞術(shù) 細胞分組同1.5 項，取對數(shù)生長期的各組MG63 細胞，0.25%胰酶消化，PBS 洗滌2 次，加入195 μL 的Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細胞；加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶染色液，混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測。

1.6.2Hoechst 染色 取對數(shù)生長期的各組MG63細胞，按每孔1 × 105個接種于6 孔板，加入0.5 mL Hoechst 染色試劑盒中的固定液，37 ℃固定10 min；PBS 洗滌2 次，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min；PBS 洗滌2 次，取一滴置玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。

1.7hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞線粒體膜電位影響的檢測 細胞分組同1.5 項，取對數(shù)生長期的各組MG63 細胞，按3 × 105個／ 孔接種于6 孔板，PBS 洗滌3 次，37 ℃孵育24 h；加入5 μg／mL的JC-1，室溫避光反應(yīng)30 min；用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強度。

1.8hsa_circ_0004771基因抑制對MG63細胞中MDA及LDH 含量影響的檢測 細胞分組同1.5 項，取對數(shù)生長期的各組MG63 細胞，采用相應(yīng)試劑盒測定LDH 和MDA 含量。

1.9hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞中Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc 表達水平影響的檢測 采用Western blot 法。細胞分組同1.5項，取對數(shù)生長期的各組MG63 細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白含量。取等量蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用TBST 稀釋的5%脫脂牛奶于4 ℃封閉2 h；加入兔抗Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc、Actin 單克隆抗體（均按1 ∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1 ∶10 000 稀釋），4 ℃孵育2 h；用雙蒸水終止反應(yīng)，ECL 顯色。ImageJ 軟件統(tǒng)計灰度值。目的條帶相對表達量以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采取t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1shRNA 的干擾效果 shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA-NC 及空白對照組MG63 細胞中hsa_circ_0004771基因相對表達量分別為0.15 ± 0.06、0.48±0.08、0.60±0.09、0.99±0.05、1.00±0.01。與空白對照組比較，shRNA-NC 組MG63 細胞中hsa_circ_0004771基因相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.340，P> 0.05），shRNA1、shRNA2、shRNA3 組均顯著降低（t分別為24.204、11.171、7.651，P均＜0.05），其中shRNA1 的干擾效果最好，因此選擇shRNA1 進行后續(xù)試驗。

2.2hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞EdU陽性細胞數(shù)的影響 shRNA1、shRNA-NC 及空白對照組EdU 陽性細胞數(shù)分別為（18.79±9.68）、（92.32±7.12）、（88.62±8.59）個。與空白對照組比較，shRNA1組EdU 陽性細胞數(shù)明顯降低（t= 9.346，P＜0.05），shRNA-NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.574，P>0.05）。見圖1。

圖1 各組MG63 細胞的EdU 陽性細胞數(shù)（EdU 染色，× 200）Fig.1 Counts of EdU positive cells in MG63 cells of various groups（EdU staining，× 200）

2.3hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞凋亡率的影響

2.3.1流式細胞術(shù) shRNA1、shRNA-NC 及空白對照組MG63 細胞凋亡率分別為（28.93 ± 2.76）%、（5.38±1.21）%、（5.42±0.83）%。與空白對照組比較，shRNA1 組MG63 細胞凋亡率明顯升高（t=14.129，P＜0.05），shRNA-NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.047，P> 0.05）。見圖2。

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組MG63 細胞的凋亡情況Fig.2 Flow cytometry of apoptosis of MG63 cells in various groups

2.3.2Hoechst 染色 shRNA1、shRNA-NC 及空白對照組MG63 細胞凋亡率分別為（31.80 ± 2.12）%、（14.08 ± 1.06）%、（12.72 ± 1.06）%。與空白對照組比較，shRNA1 組MG63 細胞凋亡率明顯升高（t=13.943，P＜0.05），shRNA-NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 1.571，P> 0.05）。見圖3。

圖3 Hoechst 染色法檢測各組MG63 細胞的凋亡情況（Hoechst 染色，× 200）Fig.3 Hoechst staining of apoptosis of MG63 cells in various groups（Hoechst staining，×200）

2.4hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞線粒體膜電位的影響 shRNA1、shRNA-NC 及空白對照組MG63 細胞線粒體膜電位分別為（2.73 ± 0.85）%、（53.13 ± 1.03）%、（51.26 ± 1.18）%。與空白對照組比較，shRNA1 組MG63 細胞線粒體膜電位明顯降低（t= 57.800，P＜0.05），shRNA-NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 2.068，P> 0.05）。見圖4。

圖4 各組MG63 細胞的線粒體膜電位Fig.4 Mitochondrial membrane potential of MG63 cells in various groups

2.5hsa_circ_0004771基因抑制對MG63細胞中MDA及LDH 含量的影響 shRNA1、shRNA-NC 及空白對照組MG63 細胞中MDA 含量分別為（4.10±0.50）、（2.36 ± 0.20）、（2.30 ± 0.30）mmol ／ L，LDH 含量分別為（1 776.62 ± 213.18）、（896.77 ± 198.61）、（878.94±245.08）U／L。與空白對照組比較，shRNA1組MG63 細胞中MDA 及LDH 含量顯著升高（t分別為5.347 和4.787，P均＜0.05），shRNA-NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為0.288 和0.098，P均>0.05）。

2.6hsa_circ_0004771基因抑制對MG63 細胞中Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc 表達水平的影響 與空白對照組比較，shRNA1 組Bax ／ Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3 比值明顯升高（t分別為22.395 和7.593，P均＜0.05），c-Myc 蛋白表達水平顯著降低（t=4.201，P＜0.05）；shRNA-NC 組Bax／Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3 比值及c-Myc 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為0.775、1.225、0.541，P均> 0.05）。見圖5 和表1。

表1 各組MG63 細胞中Bax／Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3及c-Myc 的表達水平（ ± s，n = 3）Tab.1 Expression levels of Bax ／Bcl-2，cleaved Caspase-3／Caspase-3 and c-Myc in MG63 cells of various groups（x±s，n=3）

表1 各組MG63 細胞中Bax／Bcl-2、cleaved Caspase-3／Caspase-3及c-Myc 的表達水平（ ± s，n = 3）Tab.1 Expression levels of Bax ／Bcl-2，cleaved Caspase-3／Caspase-3 and c-Myc in MG63 cells of various groups（x±s，n=3）

注：a 表示與空白對照組比較，P ＜0.05。

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圖5 Western blot 法檢測MG63 細胞中Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3、c-Myc 的表達水平Fig.5 Determination of expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase-3，cleaved Caspase-3 and c-Myc proteins in MG63 cells by Western blot

3 討 論

circRNA 在生物系統(tǒng)中廣泛表達，在哺乳動物細胞中高度保守，且較穩(wěn)定，這些特性使circRNA 可能成為診斷各種癌癥的理想生物標(biāo)志物［7］。相關(guān)研究表明，hsa_circ_0004771是一個功能性circRNA 基因，在大腸癌患者血清的外泌體中高表達，對大腸癌有一定診斷價值［8］；hsa_circ_0004771在胃癌組織中的表達水平也上調(diào)，可作為胃癌的新型診斷和動態(tài)監(jiān)測生物標(biāo)志物［9］。

細胞增殖是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，抑制腫瘤細胞增殖對臨床治療腫瘤有指導(dǎo)意義。HUANG等［10］研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004771通過miR-339-5p ／CDC25A 軸抑制食管鱗狀細胞癌增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004771shRNA 可明顯降低MG63 細胞EdU陽性細胞數(shù)，提示基因干擾hsa_circ_0004771可抑制MG63 細胞增殖。促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 可相互作用，形成的復(fù)合物比例的高低可判定細胞凋亡狀態(tài)［11］。細胞質(zhì)中的Caspase-3 一般無活性，以procaspase-3 形式存在，當(dāng)細胞受到凋亡刺激時，被激活，進而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，當(dāng)Caspase-3 活化時意味著凋亡進入不可逆階段［12］。c-Myc 為原癌基因，可介導(dǎo)腫瘤細胞無限增殖，促進腫瘤細胞凋亡，相關(guān)研究表明，c-Myc 高表達可促進骨肉瘤的發(fā)生［13］。XIE 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，敲除hsa_circ_0004771可抑制乳腺癌細胞系中的細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004771shRNA 干擾后可明顯升高MG63 細胞Bax ／ Bcl-2、cleaved Caspase-3 ／Caspase-3 比值（P＜0.05），顯著降低c-Myc 蛋白表達水平（P＜0.05）。提示干擾hsa_circ_0004771基因可誘導(dǎo)MG63 細胞凋亡。

氧化應(yīng)激是一種復(fù)雜的動態(tài)過程，其特點是保持活性氧生成與抗氧化劑的活性及有效性之間的平衡。線粒體是真核生物進行能量代謝的主要場所，在自由基產(chǎn)生、細胞凋亡和衰老等生理病理活動中發(fā)揮著重要作用，是氧化應(yīng)激的重要靶細胞器，當(dāng)線粒體的正常生理功能受到破壞，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡［15］。MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，MDA 的測定能反映脂質(zhì)過氧化水平，間接反映出細胞損傷程度［16］。LDH 屬于氧化還原類酶，參與機體的能量代謝，LDH 的含量高低反映了細胞的活力。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004771shRNA可顯著提高MG63 細胞MDA、LDH 含量（P＜0.05），明顯降低線粒體膜電位的作用（P＜0.05），提示干擾hsa_circ_0004771基因可通過改善氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)MG63 細胞增殖和凋亡。

綜上所述，hsa_circ_0004771基因干擾可抑制骨肉瘤細胞MG63 增殖，促進細胞凋亡，降低線粒體膜電位，改善氧化應(yīng)激的作用。本研究為骨肉瘤新治療策略的研究提供了實驗依據(jù)。今后也將通過動物及臨床水平驗證hsa_circ_0004771基因干擾對骨肉瘤的作用及其作用機制。