房凌旭，盧中一

1． 深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518067；

2． 深圳大學(xué)高等研究院深圳市海洋微生物組工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518060

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是自然界中廣泛存在的曲霉屬真菌，其大量產(chǎn)生的分生孢子極易播散，可被人體吸入肺部，在一定條件下對(duì)免疫力低下人群產(chǎn)生致病性。煙曲霉可引起過(guò)敏性支氣管肺曲霉病、侵襲性曲霉病和慢性肺曲霉病等［1-3］。特別是煙曲霉具有較高的抗逆特性和致病力，一方面體現(xiàn)在其細(xì)胞壁的葡聚糖和幾丁質(zhì)等成分可增強(qiáng)其對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的逃逸能力；另一方面體現(xiàn)在其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可抵抗巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧簇等［4-5］。因此，研究煙曲霉抗逆性和致病力的關(guān)鍵蛋白及相關(guān)分子機(jī)制是治療煙曲霉感染的重要前提。目前，三唑類藥物是臨床上治療煙曲霉感染的一線藥物，但臨床和環(huán)境中唑類藥物及其衍生物的廣泛施用導(dǎo)致煙曲霉逐漸產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題［6-7］。我國(guó)的一項(xiàng)研究顯示，從臨床樣品分離得到的159 株煙曲霉中，對(duì)伊曲康唑耐藥的煙曲霉陽(yáng)性率為4.4%［8］；而SEWELL等［9］發(fā)現(xiàn)，從英國(guó)南部收集到的178 份土壤樣品中檢測(cè)到的唑類耐藥煙曲霉陽(yáng)性率達(dá)6.7%。

絲切蛋白（Cofilin）是一種保守存在于真核生物中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其通過(guò)切割肌動(dòng)蛋白絲（Factin）調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架重排?，F(xiàn)有研究表明，Cofilin是參與真菌抗逆機(jī)制和耐藥機(jī)制的關(guān)鍵蛋白，為具有研究?jī)r(jià)值的抗真菌藥物靶點(diǎn)［10-11］。釀酒酵母Cofilin中部分蛋白氨基酸位點(diǎn)突變可影響線粒體功能，進(jìn)而產(chǎn)生逆行信號(hào)造成部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平升高，最終引起突變株對(duì)藥物的耐受升高［12］。此外，煙曲霉Cofilin基因高轉(zhuǎn)錄水平可引起菌株內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因和細(xì)胞壁多聚糖合成基因轉(zhuǎn)錄水平升高，提示Cofilin 在煙曲霉抗逆性和致病力方面可能具有重要作用［13］。本研究探討了Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)在煙曲霉抗逆性和致病力等方面的作用，以期為Cofilin作為治療煙曲霉感染的潛在藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 煙曲霉野生株CEA17ku80Δ（WT）由法國(guó)巴斯德研究所Jean Paul Latge'教授惠贈(zèng)；煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變菌株S5A、D19A-R21A、E48A、K36A、K36E 和D54A 由中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所韓黎研究員惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大蠟螟幼蟲(chóng)購(gòu)自玉米蟲(chóng)農(nóng)場(chǎng)公司。選取體表光滑，顏色淺亮，體重0.3 ~ 0.35 g 的大蠟螟幼蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3主要試劑 熒光白、剛果紅和FITC 偶聯(lián)的伴刀豆蛋白購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；過(guò)氧化氫（H2O2）和山梨醇購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂購(gòu)自青島海博生物科技有限公司；PCR 酶體系購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。

1.4培養(yǎng)基的配制 基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（MM）為深圳大學(xué)高等研究院深圳市海洋微生物組工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制，成分包括：1 mL Trace element solution［FeSO4·7 H2O 5 g／L、ZnSO4·7 H2O 22 g／L、MnCl2·4 H2O 5 g／L、Na4EDTA 50 g／L、（NH4）6Mo7O24·4 H2O 1.1 g／L、H3BO311 g／L、CoCl2·5 H2O 1.6 g／L 和CaCl2·2 H2O 14.7 g／L］、50 mL 20 × Salt Solution 溶液（KH2PO430.4 g ／ L、MgSO4·7H2O10.4g／L、KCl10.4g／L 和NaNO3120g／L）、10 g 葡萄糖和15 g 瓊脂；調(diào)節(jié)MM 的酸堿度，配制成pH 10 的MM 培養(yǎng)基；在MM 中加入100 mg ／ L 熒光白，配制成熒光白培養(yǎng)基；在MM 中加入200 mg／L 剛果紅，配制成剛果紅培養(yǎng)基；在MM 中加入100 mg／L的H2O2，配制成H2O2培養(yǎng)基；在MM 中加入2.4 mol／L山梨醇，配制成山梨醇培養(yǎng)基。

1.5煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)的構(gòu)建 引物序列見(jiàn)表1，由華大基因科技有限公司合成。通過(guò)引物F1和R1（引入突變位點(diǎn)），以煙曲霉菌株CEA17ku80Δ基因組為模板擴(kuò)增Cofilin 編碼基因片段及上游同源臂（長(zhǎng)度1 000 ~ 1 500 bp），同時(shí)利用引物F2 和R2 擴(kuò)增上述基因組中Cofilin 編碼基因另一部分片段；此外，分別通過(guò)引物F3 和R3、F4 和R4 以含有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒和煙曲霉基因組為模板，擴(kuò)增篩選標(biāo)記hph 片段及Cofilin 編碼基因下游同源臂（長(zhǎng)度1 000 ~ 1 500 bp）；最終利用引物F1 和R4 將上述片段按濃度比1 ∶3 ∶3 ∶1 進(jìn)行片段融合，并采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入CEA17ku80Δ 中原位替換Cofilin編碼基因，經(jīng)篩選并使用引物seqS 和seqA 測(cè)序驗(yàn)證后獲得煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變株。

表1 煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)引物Tab.1 Primers for Cofilin point mutation library of A.fumigatus

1.6煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)的抗逆性檢測(cè) 通過(guò)應(yīng)激試驗(yàn)分析Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)在不同刺激下對(duì)煙曲霉抗氧化、抗高滲透壓和抗細(xì)胞壁干擾等方面的影響。將WT 和Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)煙曲霉的孢子用滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至5 × 107個(gè)／ mL，分別取2 μL 接種至不同成分培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)60 ～72 h 后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.7煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)細(xì)胞壁甘露糖合成及分布的檢測(cè) 通過(guò)FITC 偶聯(lián)的伴刀豆蛋白熒光標(biāo)記Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)煙曲霉中的甘露糖，分析Cofilin點(diǎn)突變對(duì)煙曲霉細(xì)胞壁中甘露糖合成及分布的影響。用含0.01% Tween 20 的滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋煙曲霉孢子至5 × 107個(gè)／ mL，取2 μL 接種至含2 mL MM 液體培養(yǎng)基的6 孔板（底部放置10 mm×10 mm 蓋玻片），在37 ℃下培養(yǎng)14 ～16 h；加入200 μL FITC 偶聯(lián)的伴刀豆蛋白，在30 ℃下孵育1 h；用去離子水清洗2 次，將蓋玻片取出后倒扣至含抗熒光淬滅劑的載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)的致病力分析 采用大蠟螟幼蟲(chóng)感染試驗(yàn)分析Cofilin 點(diǎn)突變對(duì)煙曲霉致病力的影響。用含0.01% Tween 20 的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液將5 × 107個(gè)／ mL 煙曲霉孢子重懸。用微量注射器將10 μL 孢子懸液注入大蠟螟幼蟲(chóng)左排最下端腹足。設(shè)2 個(gè)對(duì)照組，一組大蠟螟幼蟲(chóng)注射10 μL 含0.01% Tween 20 的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，另一組不做任何處理。每組16 只。注射后置于37 ℃遮光培養(yǎng)，每12 h 記錄大蠟螟幼蟲(chóng)存活情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行大蠟螟幼蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)生存曲線及顯著性分析，P值及顯著性分析采用Log-rank（Mantel-Cox）檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)的位點(diǎn)選取及構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變位點(diǎn)K26A、E56A、D11A-E12A、K41A-K42A 和R59A-R61A。選取的煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)包括：?jiǎn)挝稽c(diǎn)突變S5A（第5 位點(diǎn)絲氨酸突變?yōu)楸彼幔?、K26A（第26 位點(diǎn)賴氨酸突變?yōu)楸彼幔36A（第36 位點(diǎn)賴氨酸突變?yōu)楸彼幔?、K36E（第36 位點(diǎn)賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?、E48A（第48 位點(diǎn)谷氨酸突變?yōu)楸彼幔54A（第54 位點(diǎn)天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔?、E56A（第56 位點(diǎn)谷氨酸突變?yōu)楸彼幔┮约半p突變D11A-E12A（第11 位點(diǎn)天冬氨酸和第12 位谷氨酸均突變?yōu)楸彼幔?、D19A-R21A（第19 位點(diǎn)天冬氨酸和第21 位點(diǎn)精氨酸均突變?yōu)楸彼幔41A-K42A（第41 位點(diǎn)賴氨酸和第42 位點(diǎn)賴氨酸均突變?yōu)楸彼幔┖蚏59A-R61A（第59 位點(diǎn)精氨酸和第61 位點(diǎn)精氨酸均突變?yōu)楸彼幔?，?jiàn)圖1。篩選及測(cè)序結(jié)果表明煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變株構(gòu)建正確。

圖1 煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)中選取的突變位點(diǎn)Fig.1 Mutation sites selected from Cofilin point mutation library of A.fumigatus

2.2煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)的抗逆性 相比于WT，Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)中攜帶D11A-E12A、K26A、E56A 和R59A-R61A 的煙曲霉在MM 培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)能力減弱，提示Cofilin 及其部分氨基酸位點(diǎn)對(duì)煙曲霉菌絲生長(zhǎng)具有重要作用。此外，Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)中煙曲霉對(duì)細(xì)胞壁干擾劑熒光白（100 mg ／ L）和剛果紅（200 mg ／ L）的敏感性與WT 無(wú)顯著差異，提示這些Cofilin 點(diǎn)突變可能不影響煙曲霉細(xì)胞壁完整性及細(xì)胞壁相關(guān)應(yīng)激信號(hào)通路。在pH 10 的MM 培養(yǎng)基和含有山梨醇的高滲培養(yǎng)基中，Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)中煙曲霉與WT 生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)顯著差異，提示這些Cofilin 點(diǎn)突變未影響煙曲霉對(duì)酸堿度和高滲透壓的應(yīng)激能力。但攜帶D19A-R21A 和K36A 的煙曲霉菌株在H2O2培養(yǎng)基中菌絲的生長(zhǎng)能力強(qiáng)于WT，提示這些突變導(dǎo)致煙曲霉對(duì)外界氧化壓力的耐受水平升高；而攜帶K36E 的煙曲霉菌株在H2O2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受到明顯抑制，提示該突變導(dǎo)致煙曲霉對(duì)氧化壓力的耐受能力減弱。上述結(jié)果提示，Cofilin 及其部分氨基酸位點(diǎn)在煙曲霉氧化應(yīng)激信號(hào)通路中具有重要作用。見(jiàn)圖2。

圖2 煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)抗逆性試驗(yàn)Fig.2 Stress resistance test of Cofilin point mutants of A.fumigatus

2.3煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)細(xì)胞壁中甘露糖的合成及分布 熒光顯微鏡下觀察顯示，Cofilin 點(diǎn)突變菌株與WT 的甘露糖含量無(wú)明顯區(qū)別，但攜帶K36A和E56A 的煙曲霉菌株出現(xiàn)菌絲頂端甘露糖聚集現(xiàn)象，提示這些Cofilin 位點(diǎn)突變可能影響了細(xì)胞壁中甘露糖的分布，見(jiàn)圖3。

圖3 熒光標(biāo)記Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)細(xì)胞壁中的甘露糖觀察Fig.3 Microscopy of fluorescent-labeled mannose in cell walls of Cofilin point mutants

2.4煙曲霉Cofilin 點(diǎn)突變庫(kù)的致病力 S5A、D11AE12A、K36E、K41A-K42A、E48A、D54A 對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力與WT 相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為0.182、0.495 9、0.124 4、0.567 5、0.068 89、0.236 6，P分別為0.613 4、0.561 6、0.724 3、0.551 3、0.793、0.626 7），提示這些Cofilin 點(diǎn)突變未顯著性影響煙曲霉對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力。此外，與WT 相比，D19A-R21A、K26A 和K36A 使煙曲霉對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力顯著增強(qiáng)（χ2分別為5.364、6.6、13.39，P分別為0.020 6、0.010 2、0.000 2），而E56A 和R59AR61A 使煙曲霉對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力顯著減弱（χ2分別為4.443、4.18，P分別為0.035 1、0.040 9）。上述結(jié)果顯示，Cofilin 及其部分氨基酸位點(diǎn)對(duì)煙曲霉的致病力具有重要作用。見(jiàn)圖4。

圖4 大蠟螟幼蟲(chóng)感染試驗(yàn)分析Cofilin 點(diǎn)突變對(duì)煙曲霉致病力的影響Fig.4 Analysis of effect of Cofilin point mutation on virulence of A.fumigatus by infection test in Galleria mellonella larval

3 討 論

蛋白間相互作用是蛋白行使生物學(xué)功能的重要方式，而蛋白表面的電荷分布是決定蛋白間相互作用的關(guān)鍵因素［14］。本研究利用丙氨酸掃描構(gòu)建的點(diǎn)突變庫(kù)揭示了Cofilin 在煙曲霉抗逆性和致病力等方面的作用。丙氨酸掃描是將蛋白表面帶電荷的氨基酸突變?yōu)楸彼幔栽u(píng)估蛋白功能及關(guān)鍵活性位點(diǎn)等。由于丙氨酸體積小且不帶電荷，通常認(rèn)為丙氨酸掃描僅改變蛋白表面的電荷分布而不影響蛋白結(jié)構(gòu)［15-17］。本研究選擇了煙曲霉Cofilin 中N-端的帶電荷氨基酸，由于Cofilin 的N-端存在保守的磷酸化位點(diǎn)（已證明在煙曲霉Cofilin 的第五位絲氨酸［13］），而該位點(diǎn)附近的蛋白表面可能與Cofilin 上游調(diào)控蛋白的磷酸激酶和去磷酸酶存在相互作用，因此該處帶電荷表面具有重要的生物學(xué)活性［18］。本研究中選取位點(diǎn)主要基于以下考慮：①Cofilin 是煙曲霉必需基因，過(guò)多的位點(diǎn)突變更易造成蛋白失活使菌株死亡，不利于點(diǎn)突變庫(kù)的構(gòu)建；②進(jìn)行常規(guī)的多位點(diǎn)同時(shí)突變后，往往需要在突變框內(nèi)進(jìn)行下一輪單位點(diǎn)或雙位點(diǎn)突變以確定關(guān)鍵功能位點(diǎn)，并不能根本性降低工作量；③本研究?jī)H選取感興趣的Cofilin N-端進(jìn)行突變，整體點(diǎn)突變工作量不大；④位點(diǎn)的選取主要參照了前人對(duì)釀酒酵母Cofilin位點(diǎn)的研究工作，以便進(jìn)行研究工作的橫向比較［12］；⑤選取的氨基酸位點(diǎn)主要集中于α 螺旋和β 折疊等蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域，以便分析剛性區(qū)域在Cofilin生物學(xué)功能中的重要作用。其中，單位點(diǎn)突變包括S5A、K26A、K36A、K36E、E48A、D54A 和E56A，其中S5A 用來(lái)模擬Cofilin 去磷酸化過(guò)程，K26 用來(lái)分析曲霉屬保守的Loop 區(qū)域中帶電荷氨基酸位點(diǎn)的生物學(xué)功能，K36、E48、D54 和E56 的選取參考釀酒酵母Cofilin 的研究［12］。此外，本研究引入了K36E 作為K36A 的對(duì)照，以便分析不同突變模式在研究蛋白關(guān)鍵帶電荷氨基酸功能中的作用。對(duì)于雙突變位點(diǎn)，本研究選取了D11A-E12A、D19A-R21A、K41AK42A 和R59A-R61A，這些位點(diǎn)的選取參照了前人研究中釀酒酵母的Cofilin 點(diǎn)突變模式，可能參與調(diào)節(jié)線粒體功能［12］。

本研究結(jié)果顯示，Cofilin 點(diǎn)突變D11A-E12A、K26A、E56A 和R59A-R61A 可減弱煙曲霉菌絲的生長(zhǎng)能力，該現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與點(diǎn)突變Cofilin 調(diào)控細(xì)胞骨架actin 功能的異常有關(guān)?，F(xiàn)有研究證實(shí)，Cofilin表面的帶電荷氨基酸對(duì)actin 有直接的調(diào)節(jié)作用。如釀酒酵母Cofilin 中氨基酸位點(diǎn)D10 和E11（分別對(duì)應(yīng)煙曲霉Cofilin 中的D11 和E12）參與對(duì)細(xì)胞骨架actin 的調(diào)節(jié)功能，因此這些位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致細(xì)胞骨架actin 形態(tài)異常［12］。其他研究顯示，actin 與細(xì)胞的極性生長(zhǎng)具有重要功能聯(lián)系［11］。上述研究提示，Cofilin 及其部分帶電荷氨基酸可通過(guò)調(diào)節(jié)actin的生物學(xué)功能影響煙曲霉菌絲的極性生長(zhǎng)能力。

JIA 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Cofilin基因轉(zhuǎn)錄水平升高可導(dǎo)致煙曲霉氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)，提示Cofilin 可能參與煙曲霉的氧化應(yīng)激信號(hào)通路。本研究進(jìn)一步證實(shí)，Cofilin 中的帶電荷氨基酸位點(diǎn)可能是該蛋白在煙曲霉氧化應(yīng)激中行使功能的分子基礎(chǔ)。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，K36E 與K36A 對(duì)H2O2的耐受能力不同，提示該位點(diǎn)及附近的帶電荷氨基酸（或化學(xué)側(cè)鏈）可能調(diào)控了Cofilin 在煙曲霉氧化應(yīng)激信號(hào)通路中的功能。同時(shí)也提示，除常見(jiàn)的丙氨酸和亮氨酸等點(diǎn)突變模式外，對(duì)蛋白中帶電荷氨基酸進(jìn)行反向電荷突變有助于對(duì)關(guān)鍵氨基酸功能及其分子機(jī)制的研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，Cofilin基因轉(zhuǎn)錄水平升高可導(dǎo)致煙曲霉細(xì)胞壁中β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)等合成的增加，提示Cofilin 在煙曲霉細(xì)胞壁多糖的合成及細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路中具有重要作用［13］。雖然本研究中的Cofilin 點(diǎn)突變對(duì)細(xì)胞壁中甘露糖的合成量無(wú)明顯影響，但K36A 和E56A 可引起甘露糖在煙曲霉菌絲頂端的聚集，這種現(xiàn)象可能與細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路或菌絲的極性生長(zhǎng)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Cofilin 點(diǎn)突變可影響煙曲霉對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病能力，其中D19A-R21A、K26A 和K36A 導(dǎo)致煙曲霉對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力顯著增強(qiáng)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是這些點(diǎn)突變可能提高了煙曲霉中線粒體的功能活性。其依據(jù)為釀酒酵母Cofilin 中的雙突變D18A-R20A（對(duì)應(yīng)于煙曲霉Cofilin 的D19A-R21A）可導(dǎo)致線粒體功能異?；钴S，而有研究證實(shí)，在格特隱球菌中，線粒體活性升高增強(qiáng)真菌的致病力［19］。此外，本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，E56A 和R59A-R61A 引起煙曲霉對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的致病力減弱，這一現(xiàn)象可能與這些菌株的菌絲生長(zhǎng)能力減弱有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)點(diǎn)突變庫(kù)揭示了Cofilin及其氨基酸位點(diǎn)在煙曲霉抗逆性和致病力等方面具有關(guān)鍵作用，其相關(guān)的分子機(jī)制應(yīng)是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，Cofilin 作為治療煙曲霉及其他致病真菌感染的潛在藥物靶點(diǎn)將具有廣闊的發(fā)展前景。