孔鈺琳，榮勝忠，王慧單，高 夢(mèng)，李曉霞

(牡丹江醫(yī)學(xué)院流行病與統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2020)顯示，2020年世界范圍內(nèi)新發(fā)膀胱癌約有573278例，死亡約212536例，在男性人群中，膀胱癌的發(fā)病率高居第6位且居癌癥相關(guān)性死亡原因的第9位[1]。目前，膀胱癌的治療以手術(shù)為主，但其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后[2]。因此，探索通過(guò)研究膀胱癌在分子水平的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，篩選具備診斷和預(yù)后潛力的分子標(biāo)志物、研發(fā)新型基因藥物及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

本研究通過(guò)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取膀胱癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，并利用基因本體論(gene ontology,GO)富集分析注釋基因功能，采用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析對(duì)DEGs的信號(hào)通路進(jìn)行富集，然后構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI network)，同時(shí)結(jié)合Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵基因的生存預(yù)后情況進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)膀胱癌潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的獲取進(jìn)入GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，在搜索框內(nèi)輸入“Bladder Cancer”進(jìn)行檢索，納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)樣品來(lái)自人膀胱癌組織標(biāo)本；(2)研究對(duì)象包含膀胱癌患者和正常對(duì)照；(3)研究類型為“Expression profiling by array”。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選下載數(shù)據(jù)集(GSE7476,GSE37815和GSE13507)，其中GSE7476基于GPL570平臺(tái)，GSE37815與GSE13507基于GPL6102平臺(tái)。GSE7476包括9例癌組織，3例正常組織；GSE37815包括18例癌組織，6例正常組織；GSE13507包括188例癌組織，68例正常組織。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理及差異基因的篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)自帶的在線分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)處理原始數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)分為膀胱癌組和正常組進(jìn)行分析。以|log FC(foldchange)|≥1.5且校正后P值<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)三組數(shù)據(jù)集進(jìn)行DEGs篩選。log FC≥1.5的基因作為上調(diào)差異基因(UDEGs)，log FC≤-1.5的基因作為下調(diào)差異基因(DDEGs)。篩選出各數(shù)據(jù)集中DEGs后，通過(guò)Venny在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)確定GSE7476、GSE37815和GSE13507三個(gè)數(shù)據(jù)集的相交部分。

1.2.2 DEGs的GO富集分析與KEGG通路分析 通過(guò)DAVID在線分析工具(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,https://david.ncifcrf.gov/,version 6.8)對(duì)篩選出的DEGs 進(jìn)行GO和KEGG分析。按照P<0.05為截取標(biāo)準(zhǔn)篩選GO分析和 KEGG通路分析結(jié)果。

1.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選 通過(guò)String(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,https://string-db.org/,version 11.0)在線工具構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape(version 3.7.1)軟件進(jìn)行可視化，利用Cytohubba插件，基于四種拓?fù)渌惴ǎ鹤畲缶奂行?MCC)、最大鄰域組件(MNC)、度(Degree)、邊緣滲透組件(EPC)分別篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中前十個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，最后將上述四種算法所獲得的結(jié)果取交集，將重疊的差異表達(dá)基因作為關(guān)鍵樞紐基因。

1.2.4 關(guān)鍵基因的預(yù)后分析 通過(guò)Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行評(píng)估關(guān)鍵基因的預(yù)后價(jià)值。每個(gè)基因根據(jù) mRNA表達(dá)值自動(dòng)將癌癥患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組進(jìn)行比較，生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選對(duì)GSE7476、GSE37815和GSE13507三個(gè)數(shù)據(jù)集中的DEGs取交集，最終篩選出101個(gè)DEGs，其中95個(gè)UDEGs(表1)，6個(gè)DDEGs(表2)。不同數(shù)據(jù)集的DEGs篩選結(jié)果的火山圖見(jiàn)圖1。

圖1 膀胱癌中的差異表達(dá)基因

表1 膀胱癌上調(diào)表達(dá)基因

表2 膀胱癌下調(diào)表達(dá)基因

2.2 DEGs的GO分析和KEGG信號(hào)通路分析GO富集分析，膀胱癌DEGs在細(xì)胞學(xué)過(guò)程(biological processes,BP)方面主要是參與肌肉收縮、細(xì)胞黏附、肌絲滑動(dòng)等生物過(guò)程(圖2A)。在細(xì)胞成分(cell component,CC)方面，主要分布于細(xì)胞外區(qū)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、黏著斑等組織(圖2B)。分子功能(molecular function,MF)方面，DEGs主要有肌肉結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞骨架蛋白綁定、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、鈣調(diào)蛋白的結(jié)合等分子功能(圖2C)。DEGs的KEGG信號(hào)通路分析顯示，DEGs在心肌收縮、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、黏著斑等通路中富集表達(dá)(圖2D)。

圖2 DEGs的GO分析和KEGG通路分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選為了進(jìn)一步確定篩選出的101個(gè)DEGs之間的關(guān)系，通過(guò)STRING11.0進(jìn)行分析。PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及節(jié)點(diǎn)101個(gè)，邊數(shù)157個(gè)，平均節(jié)點(diǎn)度為3.11，蛋白質(zhì)相互作用富集P值小于1.0e-16。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，標(biāo)注PPI網(wǎng)絡(luò)的上調(diào)基因(橙色)及下調(diào)基因(綠色)(圖3)，并利用MCODE插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵功能模塊，包括10個(gè)節(jié)點(diǎn)和45條邊(圖4)。利用Cytohubba插件，根據(jù)MCC，MNC，Degree和EPC這四種拓?fù)渌惴êY選出排名前十的關(guān)鍵基因(表3和圖5)，確定了9個(gè)重疊差異表達(dá)基因?yàn)殛P(guān)鍵基因，即TPM1、ACTC1、ACTA2、TPM2、TAGLN、CALD1、LMOD1、MYH11、CNN1。

圖3 膀胱癌差異表達(dá)基因編碼蛋白作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵模塊

表3 基于Cytohubba插件篩選差異表達(dá)關(guān)鍵基因

圖5 基于Cytohubba插件篩選差異表達(dá)關(guān)鍵基因的韋恩圖

2.4 關(guān)鍵基因的預(yù)后分析利用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)后分析，對(duì)于每個(gè)基因根據(jù)mRNA表達(dá)值自動(dòng)將癌癥患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組進(jìn)行比較，P<0.05表示對(duì)膀胱癌患者有顯著影響。在Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中共有405例膀胱癌患者用于分析總生存率，分析結(jié)果顯示9個(gè)關(guān)鍵基因(TPM1、ACTC1、ACTA2、TPM2、TAGLN、CALD1、LMOD1、MYH11、CNN1)的上調(diào)差異表達(dá)均顯著影響膀胱癌患者的總生存率，見(jiàn)圖6。

圖6 膀胱癌關(guān)鍵基因的預(yù)后分析

3 討論

膀胱癌是我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中根據(jù)是否侵犯逼尿肌分為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，盡管有經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)、放療、化療和BCG免疫療法等多種治療手段，但膀胱癌的生存率在近三十年里都未有改善[2]。膀胱癌作為一種異質(zhì)性疾病，已造成巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，膀胱癌的早期篩查以及早期診斷顯得尤為重要，探索有效的腫瘤標(biāo)志和治療靶點(diǎn)對(duì)膀胱癌的診療十分必要。

本研究從GSE7476、GSE37815和GSE13507三個(gè)數(shù)據(jù)集中共篩選出101個(gè)DEGs，基于生物信息學(xué)對(duì)膀胱癌DEGs的功能和信號(hào)通路進(jìn)行分析，并通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)以及利用Cytoscape軟件獲得與膀胱癌密切相關(guān)的9個(gè)關(guān)鍵基因，Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)探究關(guān)鍵基因與膀胱癌預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)9個(gè)關(guān)鍵基因皆與病人的預(yù)后顯著相關(guān)。基于以上結(jié)果，推測(cè)這9個(gè)關(guān)鍵基因可能作為腫瘤基因參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究的KEGG信號(hào)通路分析表明，DEGs在心肌收縮、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、黏著斑等通路中富集表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)ACTC1、TPM1的突變與肥厚型心肌病的發(fā)展密切相關(guān)[3-4]，主要因?yàn)锳CTC1、ACTA2、TPM1、TPM2、TAGLN都屬于肌動(dòng)蛋白家族，肌動(dòng)蛋白是一類廣泛分布于生物界的高度保守的蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用[5]，且肌動(dòng)蛋白裝配動(dòng)力學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞突起是細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵步驟[6]。

TAGLN是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和腫瘤抑制因子[7]，此前已被報(bào)道參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，TAGLN在體外能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，在體內(nèi)能抑制腫瘤發(fā)生[8-9]。

而ACTA2、ACTC1、TPM1、TPM2、CALD1、LMOD1、MYH11和CNN1雖在膀胱癌中尚未見(jiàn)報(bào)道，但它們的致癌作用在部分腫瘤中已被證實(shí)。ACTC1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)顯著上調(diào)，可抑制癌細(xì)胞的遷移[10]。并且ACTC1與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后相關(guān)，可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的一種新型的預(yù)后標(biāo)志物[11]。CALD1作為一種細(xì)胞骨架蛋白[12]，它的錯(cuò)配導(dǎo)致的1-CAD表達(dá)上調(diào)會(huì)引發(fā)膠質(zhì)瘤新生血管功能異常[13]。另外研究發(fā)現(xiàn)LMOD1可作為一種新的胃癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控FAK-Akt/mTOR通路誘導(dǎo)EMT[14]。

CNN1在乳腺癌中起腫瘤抑制作用，作為miR-106b-5p的下游靶標(biāo)，其表達(dá)水平在乳腺癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)，與miR-106b-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR-106b-5p可以通過(guò)靶向CNN1和Rho / ROCK1通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞癌變[15]。

綜上所述，本研究分析了TPM1，ACTC1，ACTA2，TPM2，TAGLN，CALD1，LMOD1，MYH11，CNN1這9個(gè)基因的上調(diào)差異表達(dá)均顯著影響膀胱癌患者的總生存率。因此，本研究將為今后膀胱癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的分子機(jī)制研究提供初步的理論依據(jù)。但本研究尚有局限性，仍需要結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床樣本來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證這些關(guān)鍵基因在體內(nèi)外的作用機(jī)制。