王琦玉，張洪艷，王 雪，徐璐璐，熊君偉，關(guān)艷中

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精使用障礙(Alcohol use disorder,AUD)是一種慢性疾病?；颊弑憩F(xiàn)出強(qiáng)迫性飲酒，不飲酒時(shí)表現(xiàn)出消極的情緒[1-2]。突觸可塑性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)[3-4]。它可以通過(guò)增加或降低突觸強(qiáng)度來(lái)處理和存儲(chǔ)信息。課題組發(fā)現(xiàn)，暴露于酒精會(huì)阻斷大鼠VTA多巴胺神經(jīng)元上GABAA受體介導(dǎo)的突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)[5](Long-term potentiation of GABAergic synapses,LTPGABA)。但酒精對(duì)GABA神經(jīng)元形態(tài)學(xué)產(chǎn)生的影響尚未闡明。Li[6]等人在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠在戒斷后72 h的酒精攝入量明顯高于戒斷0 h組。因此把戒斷72 h作為一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在以下實(shí)驗(yàn)中分別進(jìn)行探究。研究主動(dòng)飲酒對(duì)VTA GABA的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響，可以為AUD的臨床預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180～200 g，購(gòu)自牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYKX(黑)2019-006。所有動(dòng)物被單獨(dú)飼養(yǎng)在通風(fēng)的有機(jī)玻璃籠中，在受控的燈照(12 h光照和12 h黑暗)，溫度20～25 ℃，接受過(guò)濾水和動(dòng)物食品。所有程序均通過(guò)《國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用衛(wèi)生指南》和牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指南批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 5%水合氯醛，無(wú)水乙醇，4%多聚甲醛，蔗糖(≥99.5%，BioReagent)，櫻花冷凍包埋劑(OCT)，丙酮，免疫染色通透液(triton x-100)，PBS緩沖液(干粉)，BSA，Anti-GAD67，抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗，DAPI，抗熒光淬滅封片液，2.5%戊二醛固定液，二甲胂酸鈉緩沖液，1%四氧化鋨，812環(huán)氧樹(shù)脂，2%醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀(M3，國(guó)Molecular Devices 公司)，激光共聚焦顯微鏡(Fv1000，奧林帕斯)，透射電鏡(2100 plus，日本日立)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型的建立 大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組和飲酒組。飲酒組大鼠在第1天上午8點(diǎn)，接受兩瓶液體，分別是100 mL 20%的酒精和100 mL水。在飲用水和酒精24 h之后，記錄大鼠的液體攝入量，置換酒瓶放入一瓶水，此時(shí)飲酒組大鼠飲用兩瓶水(戒斷期)，24 h之后置換出兩個(gè)水瓶，放入100 mL 20%的酒精和100 mL水，酒瓶與水瓶的位置與第1天相反，以控制側(cè)邊偏好，以此模式循環(huán)4周，飲酒量達(dá)到3.2 g/(kg·24 h)為酒精成癮大鼠。對(duì)照組大鼠自由飲用兩瓶水。每周對(duì)大鼠的體重進(jìn)行測(cè)量。

1.2.2 免疫熒光測(cè)定大鼠VTA GABA神經(jīng)元 將30只雄性SD大鼠，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)，飲酒組(n=20)。按上述方法建立模型，將酒精成癮大鼠分為戒斷0 h組和戒斷72 h組。使用水合氯醛(0.7 mL/100g)將大鼠麻醉，解剖后經(jīng)心臟左心室灌注生理鹽水(100～150 mL)，取腦組織于4%的多聚甲醛中固定1 h，30%蔗糖脫水。分離VTA組織(bregma-4.30～bregma-6.30 mm)，OCT膠包埋，冰凍切片5 μm，4 ℃丙酮固定，PBS洗滌(5 min×3)，tritonX-100通透后PBS洗滌(5 min×3)，5%BSA封閉1 h，吸去血清，加一抗(Anti-GAD67)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。PBS洗滌(5 min×3)，熒光二抗[抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗]暗處30 min，PBS洗3次，DAPI染色10 min，PBS洗3次，封片使用激光共聚焦顯微鏡觀察。每個(gè)樣本選取3張切片觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野拍片、計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.3 Elisa測(cè)定大鼠VTA谷氨酸脫羧酶(GAD) 選取35只雄性SD大鼠，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和飲酒組(n=25)。建立模型后，將酒精成癮大鼠分為戒斷0 h組和戒斷72 h組。腦組織勻漿離心取上清液。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，對(duì)照孔，樣品孔。依次加入樣品，酶標(biāo)試劑。封板37 ℃溫育1 h，洗滌5次后拍干。加入顯色劑、37 ℃避光顯色1 min，加入終止液，測(cè)吸光度。

1.2.4 大鼠VTA神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的觀察 選取20只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)和飲酒組(n=14)。建立模型后，將酒精成癮大鼠分為戒斷0 h組和戒斷72 h組。取腦組織，大小為1 mm3，用2.5%戊二醛和二甲胂酸鈉緩沖液固定；用1%四氧化鋨(OsO4)后固定，脫水；環(huán)氧樹(shù)脂浸潤(rùn)。超薄切片70 nm在網(wǎng)格上用2%醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行染色，酒精脫水。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)本在3個(gè)不同視野中觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPad Prism 7作圖，不同組間使用Dunnet-t和t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酒精對(duì)大鼠VTA GABA神經(jīng)元數(shù)量的影響與對(duì)照組(135.90±9.92)個(gè)/mm2相比，戒斷0 h組GABA神經(jīng)元計(jì)數(shù)(77.88±9.33)個(gè)/mm2和戒斷72 h組GABA神經(jīng)元計(jì)數(shù)(78.63±9.50)個(gè)/mm2均明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)差異(F2,23=110.7，P<0.01)。戒斷0 h組和戒斷72 h組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(t=0.16，P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 SD大鼠VTA GABA神經(jīng)元激光共聚焦圖像(×400，比例尺=50 μm)

2.2 酒精對(duì)大鼠VTA大鼠谷氨酸脫羧酶(GAD)的影響與對(duì)照組(46.92±3.27)ng/mL相比，戒斷0 h組的GAD含量(32.21±4.79)ng/mL和戒斷72 h組GAD含量(33.04±2.79)ng/mL均明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)差異(F2,27=49.45，P<0.01)。戒斷0 h組和戒斷72 h組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(t=0.47，P>0.05)。

2.3 酒精對(duì)大鼠VTA神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組線粒體結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)完整；戒斷0 h組與戒斷72 h組神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹變性、嵴斷裂，神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)松懈，密度降低，見(jiàn)圖2。

圖2 VTA神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(28000)

注：A、B、C為神經(jīng)元髓鞘；D、E、F為胞質(zhì)內(nèi)線粒體

3 討論

γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)突觸活動(dòng)與AUD的形成和發(fā)展關(guān)系密切，包括獎(jiǎng)賞、戒斷和復(fù)發(fā)等。突觸可塑性，即神經(jīng)元之間突觸傳遞發(fā)生增強(qiáng)或減弱的改變。研究發(fā)現(xiàn)突觸可塑性在AUD中發(fā)揮重要作用[7]。突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)的狀態(tài)稱為L(zhǎng)TP。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)暴露于酒精會(huì)阻斷大鼠VTA多巴胺神經(jīng)元上GABAA受體介導(dǎo)的突觸傳遞的長(zhǎng)期增強(qiáng)(LTPGABA)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)主動(dòng)飲酒減少VTA GABA神經(jīng)元的數(shù)量。Smile等也發(fā)現(xiàn)，酒精會(huì)降低GABA神經(jīng)元數(shù)量[8]。他們檢測(cè)了出生后第7天酒精處理后成年小鼠皮層體積、厚度和細(xì)胞組織的變化，發(fā)現(xiàn)腦體積在酒精處理下減少10～13%，大腦皮層表現(xiàn)出相似的減少，神經(jīng)元總數(shù)下降幅度約為8%，GABA神經(jīng)元數(shù)量顯著減少30%。在C57BL/6和BALB/cJ小鼠品系中也發(fā)現(xiàn)了類似的酒精效應(yīng)。

GABA是控制突觸興奮、抑制所需的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它由GAD合成[9-11]。GAD為GABA神經(jīng)元的特異性標(biāo)記酶，它的表達(dá)和活性與GABA水平以及抑制突觸的GABA能神經(jīng)傳遞高度相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示酒精會(huì)降低VTA GAD表達(dá)，提示主動(dòng)飲酒可能抑制VTA GABA合成。但Lee S E[12]等人發(fā)現(xiàn)，急性和短期酒精使大鼠腦各區(qū)域GAD活性升高。這種差異可能是不同腦區(qū)對(duì)酒精的反應(yīng)不同造成的。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了VTA神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，對(duì)照組線粒體結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)完整；戒斷0 h組與戒斷72 h組神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹變性、嵴斷裂，神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)松懈，密度降低。Cui Z J[13]等人發(fā)現(xiàn)，在飲酒的動(dòng)物中，突觸的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。突觸間隙的寬度明顯減少，并伴有突觸后膜增厚，突觸囊泡數(shù)量減少。Skuja S等人[14]對(duì)酒精使用者前額葉皮質(zhì)、紋狀體和黑質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元軸突末梢不腫大或輕微腫大，并含有大量突觸囊泡，突觸前和突觸后膜增厚，軸突末梢包含有規(guī)則形狀的線粒體，嵴變窄且略彎曲等，軸突呈不規(guī)則形狀，包括腎形，線粒體呈不同程度的管狀嵴擴(kuò)張。樹(shù)突表現(xiàn)為明顯腫脹，微管很少，體積增大，線粒體腫脹，嵴縮小。這與我們的研究結(jié)果相一致，表明酒精可以損害神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

綜上所述，主動(dòng)飲酒會(huì)降低GABA神經(jīng)元數(shù)量，損害GABA神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)，對(duì)酒精成癮中樞機(jī)制探索和臨床防治提供了科學(xué)資料。