張思瑾，肖嘉懿，李彩娟

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，對(duì)女性的健康及生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的最新數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已經(jīng)超過肺癌成為全球第一大癌癥[1]。肝臟是乳腺癌轉(zhuǎn)移的第三常見部位，占轉(zhuǎn)移性乳腺癌的8%～14%。腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，而微環(huán)境中的主要成分為成纖維細(xì)胞如我們研究的肝星狀細(xì)胞。在乳腺癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的過程中有一種發(fā)揮重要作用的載體叫做外泌體(Exosomes)，外泌體是一種由活細(xì)胞分泌的直徑為30～200 nm的細(xì)胞外囊泡，其內(nèi)含有細(xì)胞特異的DNA、RNA及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，廣泛的參與血管再生、細(xì)胞遷移及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2]。我們旨在探究乳腺癌細(xì)胞外泌體對(duì)肝臟基質(zhì)微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步研究乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)所用的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和人肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate,HSC)細(xì)胞株LX2均從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院的細(xì)胞庫購買。高糖DMEM培養(yǎng)基及PBS來自中國(guó)的meilunbio公司。胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)來自澳大利亞的AusGeneX公司。去外泌體的FBS購自澳大利亞的Gibco公司。外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)、內(nèi)參蛋白β-actin均購自美國(guó)Abcam公司。熒光染料PKH67購自美國(guó)的Sigma公司。熒光染料DAPI來自中國(guó)的碧云天公司。超高速離心機(jī)及超高速離心管均購自美國(guó)的Beckman公司。透射電子顯微鏡購自美國(guó)FEI公司。電泳儀及相應(yīng)轉(zhuǎn)膜裝置均購自美國(guó)的Bio-Rad公司?；罴?xì)胞熒光顯微鏡來自德國(guó)的Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和LX2的常規(guī)培養(yǎng)均用含1%雙抗、10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度超過80%時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞的傳代或凍存。在提取外泌體時(shí)，培養(yǎng)液中的FBS需要換成無外泌體的FBS。

1.2.2 外泌體提取與純化 采用超速差速離心法進(jìn)行外泌體提取，收集細(xì)胞上清于離心管中，首先300 ×g離心10 min，去除細(xì)胞沉淀，隨后2000 ×g離心10 min去除細(xì)胞碎片，10000 ×g離心30 min，接著用0.22 μm濾器過濾，100000 ×g離心2 h，收集沉淀并用無菌PBS重懸，最后100000 ×g離心2 h，進(jìn)行外泌體純化，均在4 ℃條件下進(jìn)行離心，重懸后外泌體置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察外泌體 滴樣品200 μL于封口膜上，把200目銅網(wǎng)的芳華膜面置于樣品上，10 min后豎起銅網(wǎng)用無菌濾紙吸干。滴負(fù)染液200 μL于封口膜上，把吸附完樣品的銅網(wǎng)膜面置于液體上1 min，豎起銅網(wǎng)用無菌濾紙吸干。膜面向上方于鋪滿濾紙的干燥玻璃皿內(nèi)，紅外燈下10 min烤干。置于透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)及大小。

1.2.4 粒徑分析 通過Nano Measurer軟件進(jìn)行粒徑分析，分析外泌體粒徑的分布范圍。

1.2.5 蛋白印跡分析 提取乳腺癌細(xì)胞外泌體總蛋白，按RIPA∶PMSF=1∶100的比例進(jìn)行裂解液的配置，加入200 μL裂解液，冰上裂解30 min，期間每5 min吹打一次。移至1.5 mL EP管中，在4 ℃環(huán)境下，12000 r離心10 min。吸取上清液至預(yù)冷干凈的1.5 mL EP管中并做好標(biāo)記。加入適量5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。根據(jù)目的蛋白分子量大小配置SDS-PAGE凝膠，然后上樣，電泳80 V 30 min在轉(zhuǎn)到120 V 40 min，轉(zhuǎn)膜180 mA 65 min。接著用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗3次，每次10 min。加入一抗，4 ℃環(huán)境下?lián)u床孵育過夜。結(jié)束后TBST洗3次，每次10 min。加入二抗室溫室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。配置顯色液(AB液各200 μL)進(jìn)行曝光顯影。

1.2.6 攝取實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX2細(xì)胞，鋪于6孔板，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后去除舊培養(yǎng)液，PBS洗3次。取外泌體-PBS懸液，加入PKH67熒光染料，染色4 min后加入等體積的無外泌體 FBS結(jié)合多余染料來終止染色。將染色后的外泌體加入LX2細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h后，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗3次。在孔板中加入DAPI染料染色10 min，用PBS洗3次。在載玻片上滴少量封片液，封片后進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞外泌體的分離與鑒定我們觀察到外泌體為圓形或類圓形的雙層膜性囊泡狀結(jié)構(gòu)，如圖1所示。粒徑分布比較集中，主要分布在30～200 nm范圍內(nèi)，如圖2。并且能夠表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD63，如圖3。綜上結(jié)果顯示，我們通過超速差速離心法提得的細(xì)胞外囊泡為外泌體。

圖1 乳腺癌細(xì)胞外泌體粒徑分析，標(biāo)尺為100nm

圖2 乳腺癌細(xì)胞外泌體電鏡圖范圍

圖3 外泌體標(biāo)志蛋白CD63表達(dá)

2.2 乳腺癌細(xì)胞外泌體被LX2攝取我們觀察到PKH67熒光標(biāo)記的外泌體為綠色(圖4A)，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核為藍(lán)色(圖4B)，經(jīng)過共孵育后外泌體進(jìn)入LX2緊貼細(xì)胞核(圖4C)，說明乳腺癌細(xì)胞外泌體可以被LX2攝取。

圖4 PKH67標(biāo)記的外泌體(綠色)能被DAPI標(biāo)記的LX2(藍(lán)色)攝取

2.3 乳腺癌細(xì)胞外泌體激活LX2我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳腺癌細(xì)胞外泌體處理的LX2(Exosomes組)與未經(jīng)外泌體處理的LX2(Control組)相比，α-SMA的表達(dá)水平顯著增高，如圖5所示。結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞外泌體可以激活LX2為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。

圖5 乳腺癌細(xì)胞外泌體與LX2共孵育后，α-SMA的表達(dá)

3 討論

TME主要由促瘤成分如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)、腫瘤血管、M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAMs)、輔助性T細(xì)胞-2(T helper-2,Th2)細(xì)胞因子及抑瘤成分構(gòu)成。CAFs是一種重要的基質(zhì)細(xì)胞，在應(yīng)激、炎癥、癌細(xì)胞等刺激下被激活成為一種肌成纖維細(xì)胞，標(biāo)志為表達(dá)α-SMA及成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)等[3]?，F(xiàn)已證實(shí)TME在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了重要作用[4]。例如，Yan等[5]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞外泌體中的miR-105可以激活CAFs中的MYC基因信號(hào)，使CAFs的特征能根據(jù)微環(huán)境中的代謝變化來做出改變。然而，關(guān)于腫瘤細(xì)胞外泌體對(duì)遠(yuǎn)處預(yù)轉(zhuǎn)移器官基質(zhì)細(xì)胞作用的研究甚少，尤其是在乳腺癌肝轉(zhuǎn)移方面。我們的實(shí)驗(yàn)在體外證實(shí)高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞外泌體能夠誘導(dǎo)肝成纖維細(xì)胞發(fā)生與腫瘤相關(guān)的改變，即轉(zhuǎn)化為CAFs表型，使其有利于支持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

外泌體粒徑介于30～200 nm之間，具有脂質(zhì)雙層膜的細(xì)胞外囊泡結(jié)構(gòu)，沉降離心力為100000 g，膜上標(biāo)志蛋白為CD63、CD9、CD81等。外泌體廣泛分布在外周血液、唾液、尿液及其他體液中[6]，許多細(xì)胞都能分泌外泌體[7]，外泌體能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲等多種病理生理過程[8]。外泌體作為細(xì)胞之間的通訊工具，可以使遠(yuǎn)處待轉(zhuǎn)移部位發(fā)生一系列變化，如高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞外泌體miR-1247-3p通過靶向 B4GALT3使β1-整合素-NF-κB 信號(hào)通路激活，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞分泌促炎因子來塑造炎癥微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)肝癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[9]。此外，外泌體是微環(huán)境成分之間相互作用的重要載體，阻斷外泌體的通訊已被視為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)，例如減少外泌體的生物合成及釋放、減少受體細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取及減少血漿中外泌體的數(shù)量等。Peng等[10]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-34c-5p可以減少急性髓系的外泌體生成，并可通過誘導(dǎo)衰老促進(jìn)急性髓系腫瘤細(xì)胞的清除。

LX2在正常生理狀態(tài)下表現(xiàn)為靜息狀態(tài)，當(dāng)受到多種外界因素干擾時(shí)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)[11]?；罨腖X2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白沉積物增多，這與腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生及發(fā)展存在密切的聯(lián)系[12-13]。而靜息狀態(tài)下的LX2在炎癥或損傷信號(hào)等因素的刺激下定向轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，這會(huì)使細(xì)胞的增殖和收縮能力增強(qiáng)，在分子層面上表現(xiàn)為α-SMA、FAP及胞膜受體表達(dá)增多等。另一方面，活化的LX2所分泌的細(xì)胞因子可以為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的TME，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[14]。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)，不僅慢性肝臟炎癥因子、細(xì)胞因子和活性氧可激活LX2，細(xì)胞外囊泡、微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA等也進(jìn)行了參與，其中就包括外泌體。例如李飛飛[15]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體能夠被LX2攝取并將LX2轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。

我們通過超速差速離心法提取了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞外泌體，并通過透射電子顯微鏡、Nano Measurer軟件和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)提得的外泌體進(jìn)行鑒定分析。發(fā)現(xiàn)外泌體呈圓形或類圓形的雙層膜樣囊泡，粒徑大部分分布在30～200 nm之間，符合外泌體的形態(tài)、粒徑特征，并通過WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)，進(jìn)一步證明我們提取的是外泌體。通過攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞外泌體可以被LX2攝取，表明外泌體內(nèi)的成分可以轉(zhuǎn)移到LX2內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究表明，LX2在體外培養(yǎng)7～10 d時(shí)會(huì)自動(dòng)活化，我們將其設(shè)置為對(duì)照組；將乳腺癌細(xì)胞外泌體與LX2共孵育后設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，在48 h后提取LX2蛋白進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組α-SMA的表達(dá)明顯升高，說明LX2在外泌體的作用下，被激活成CAFs。綜上所述，高侵襲性乳腺癌細(xì)胞外泌體可以被LX2攝取并激活LX2轉(zhuǎn)變?yōu)镃AFs。

通過我們的研究可以引申出這樣一個(gè)問題，即具體是外泌體中的何種成分導(dǎo)致了肝肌成纖維細(xì)胞的活化，活化后的CAFs又是通過何種機(jī)制去作用于周邊基質(zhì)微環(huán)境的。接下來我們將檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞外泌體中高表達(dá)的miRNA，通過生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)其靶基因，通過實(shí)驗(yàn)來證實(shí)其對(duì)CAFs活化的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究為進(jìn)一步研究乳腺癌細(xì)胞外泌體活化肝肌成纖維細(xì)胞為CAFs的機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為研究CAFs如何影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移提供了參考，有望為乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷及治療提供新思路。