李 艷，劉 靜，劉 健

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦瘤科，安徽 蚌埠 233000)

研究表明，楊梅素具有多種病理生理特性，包括抗氧化、抗病毒、抗微生物和抗血小板特性[1-2]。楊梅素可通過(guò)多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用，如抑制異常細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡；激活相關(guān)信號(hào)通路；抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移[3-5]。在多種類黃酮化合物研究中，楊梅素抑制酶活性和細(xì)胞增殖活性作用最強(qiáng)[6]。本團(tuán)隊(duì)一直致力于在研究楊梅素衍生物體外抗腫瘤活性，其中發(fā)現(xiàn)楊梅素衍生物H10[5,7-二甲氧基-3-(4-(4-(3-三氟甲基苯基)磺?；?哌嗪-1-基)丁氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮，結(jié)構(gòu)式如圖1]表現(xiàn)出對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460有較好的體外抗腫瘤活性。研究證實(shí)天然產(chǎn)物在控制癌癥進(jìn)展方面具有顯著效果。本團(tuán)隊(duì)以天然產(chǎn)物楊梅素的衍生物H10為研究對(duì)象，檢測(cè)了該目標(biāo)化合物對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460體外生物活性，以期為該類藥物的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人類肺腺癌細(xì)胞(H460)購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司，RPMI medium1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO 公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DMSO、DAPI、ACTIN染色劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)H460細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 H10制備和儲(chǔ)存液及工作液的配制以楊梅苷為原料，碘甲烷為甲基化試劑，在酸性條件下脫苷得到3-羥基-5,7-二甲氧-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(楊梅素中間體1)，然后再與1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷反應(yīng)生成中間體2。取代磺酰氯和哌嗪反應(yīng)制得中間體6，根據(jù)活性拼接原理，然后中間體6與中間體2反應(yīng)合成一系列含磺酰胺的楊梅素衍生物B，其合成路線如圖1。

圖1 含磺酰胺的楊梅素衍生物B系列的合成路線

本研究中的目標(biāo)化合物H10(結(jié)構(gòu)式如圖2)為楊梅素衍生物B系列之一。

圖2 楊梅素衍生物H10的結(jié)構(gòu)式

以DMSO為溶劑、配制20 mM、10 mM、5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM濃度的H10作為儲(chǔ)備溶液，并在4 ℃下儲(chǔ)存。在含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋液作為工作液。

1.4 四甲基偶氮唑鹽法(MTT比色法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度在每孔3000。板四周每孔各加100 μL的無(wú)菌水封邊，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取20 mM、10 mM、5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM濃度的H10儲(chǔ)存液在含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，按1∶1000配成工作液，每組6個(gè)復(fù)孔，DMSO按比例1∶1000稀釋作為陰性對(duì)照組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，隨后每孔加入10 μL的MTT工作溶液，放置保溫箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO溶解形成MTT在細(xì)胞內(nèi)形成的甲瓚,酶標(biāo)儀測(cè)定OD-592 nm，計(jì)算每個(gè)濃度的抑制率。抑制率(%)=[1-(處理組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)]×100%。

1.5 DAPI-Actin染色將H460細(xì)胞(3×104)接種于24孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，取10 mM的H10儲(chǔ)備液0.8 μL加入到0.8 mL的完全培養(yǎng)基中，DMSO作陰性對(duì)照，24 h后，PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min。加入Actin-tracker-green染色液，每孔200 μL，孵育30 min，PBS洗兩遍，每次5 min。加入1 μg/mL DAPI染色工作液，每孔200 μL，孵育10 min。PBS洗兩遍，每次5 min。熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，于6孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，每孔500個(gè)細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，取2 mM、5 mM、10 mM的H10儲(chǔ)備液2 μL加入到2 mL的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，DMSO作陰性對(duì)照，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)2～3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入甲醇1 mL/孔，固定25 min。去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液，染色10 min。用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

1.7 細(xì)胞成像將細(xì)胞暴露于10 μM的H10藥物48 h，并通過(guò)倒置顯微鏡觀察藥物作用后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.8 傷口愈合實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，預(yù)先在6孔板底畫(huà)直線，間距為0.5 cm，接種細(xì)胞密度每孔8×105。保溫箱培養(yǎng)24 h后，用200 μL的黃色槍頭垂直于直線，刮出劃痕，PBS清洗兩次，于倒置顯微鏡下觀察拍照(0 h拍照)，取10 mM的H10儲(chǔ)存液2 μL加入到2 mL的完全培養(yǎng)基中，DMSO作陰性對(duì)照，24 h后取出，PBS清洗兩次，倒置顯微鏡下觀察拍照，利用 Image J計(jì)算劃痕面積值。遷移率(%)=[(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積]×100%

1.9 流式分析細(xì)胞凋亡將H460細(xì)胞(2×105)接種于6孔板中，保溫箱過(guò)夜，取10 mM的H10儲(chǔ)存液2 μL加入到2 mL的完全培養(yǎng)基中，同上，DMSO作陰性對(duì)照，保溫箱培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，懸浮在結(jié)合緩沖液中。加入2.5 μL FITC Annexin V和1 μL碘化丙啶(PI)，室溫黑暗中孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用FlowJo-V 10軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.10 數(shù)據(jù)分析計(jì)量數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Graphpad Prism 8.0軟件分析作圖，統(tǒng)計(jì)方法采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H10抑制H460細(xì)胞的增殖能力MTT比色法結(jié)果如圖3，將40 mM、20 mM、10 mM、5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.1 mM H10儲(chǔ)存液在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋，作用肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞48 h，與對(duì)照組相比，隨著濃度的升高，細(xì)胞抑制率逐漸增加，P<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 H10在肺癌細(xì)胞H460中IC50值

2.2 H10處理H460細(xì)胞后，促使細(xì)胞形態(tài)皺縮、變圓及碎裂倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4，將80 mM、40 mM、10 mM、5 mM、1 mM的H10儲(chǔ)存液在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中按1∶1000進(jìn)一步稀釋。隨著H10藥物濃度增加，H460細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞縮小，變圓變亮,周?chē)霈F(xiàn)細(xì)胞碎片。

圖4 H10處理肺癌細(xì)胞H460后形態(tài)學(xué)變化

2.3 H10抑制H460細(xì)胞形成克隆斑結(jié)果如圖5，將濃度為10 mM、5 mM、2 mM的H10按1∶1000配成工作液作用肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞，與DMSO對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞隨著H10藥物濃度的升高，克隆細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目明顯減少。DMSO組的克隆形成率為(101.93±8.86)%；2 μM濃度組：(39.67±4.64)%；5 μM濃度組：(21.67±1.7)%；10 μM濃度組：(4.13±0.5)%；P<0.001。

圖5 H10處理肺癌細(xì)胞H460后的克隆斑形成結(jié)果

2.4 H10促使H460細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變結(jié)果如圖6，將濃度為10 μM的H10作用肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞24 h，觀察到對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈近橢圓形，外觀較大，染色均勻，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形態(tài)呈近不規(guī)則，外觀較小，染色不均勻，胞核開(kāi)始出現(xiàn)明顯的固縮或分裂，多可看到胞質(zhì)及核碎塊狀熒光，即典型的凋亡細(xì)胞核特征。

圖6 H10處理肺癌細(xì)胞H460后的免疫熒光染色結(jié)果

2.5 H10抑制H460遷移結(jié)果如圖7，將濃度為10 μM的H10作用肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移率明顯被抑制。對(duì)照組遷移率為(14.82±1.82)%，實(shí)驗(yàn)組遷移率為(10.00±1.32)%，P=0.02。

圖7 H10處理肺癌細(xì)胞H460后的細(xì)胞遷移結(jié)果

2.6 H10誘導(dǎo)H460凋亡Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖8，使用濃度為10 μM的H10處理H460細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，對(duì)照組的總凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)：(10.22±0.82)%；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯增加，總凋亡率:(50.27±5.05)%；P=0.00038。

圖8 H10處理肺癌細(xì)胞H460后的凋亡結(jié)果

3 討論

肺癌是最常見(jiàn)的腫瘤死亡原因。治療手段主要以手術(shù)為主，輔以放化療治療[1]。然而放化療的不良反應(yīng)嚴(yán)重，目前急需一種有效方法，減輕癌癥患者癥狀，加強(qiáng)治療療效。自然界中，多酚類物質(zhì)種類繁多，人類飲食中最常見(jiàn)的多酚類物質(zhì)是類黃酮[2]。黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、低毒等特性[3-4]。研究表明，黃酮類化合物可增強(qiáng)化療療效，改善患者預(yù)后[1,5-6]。其中楊梅素是一種作用較強(qiáng)的黃酮類化合物，在多種腫瘤中均可影響腫瘤的惡性進(jìn)程，如肝癌、乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌等[4-10]。目前楊梅素類藥物是否使患者獲益的相關(guān)臨床研究數(shù)量較少，臨床前研究數(shù)據(jù)的增加支持了楊梅素的有益作用[2]。因此，研究這類藥物在抗腫瘤、輔助放化療等方面的作用值得我們進(jìn)行的深入研究。

本課題組一直致力于研究楊梅素類衍生物的抗腫瘤活性篩選。本研究以肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞為篩選模型，使用MTT比色法進(jìn)行篩選，結(jié)果表明楊梅素類衍生物H10表現(xiàn)出較強(qiáng)體外抗腫瘤作用。因?yàn)樵谀[瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞增殖、遷移等行為學(xué)變化，細(xì)胞畸形、細(xì)胞膜泡的形成、凋亡小體的出現(xiàn)和核碎裂等形態(tài)學(xué)變化是十分重要的[11]。因此H10對(duì)細(xì)胞的影響具有潛在的研究?jī)r(jià)值。本研究將不同濃度H10作用肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞后，不僅測(cè)出細(xì)胞的吸光度值隨濃度增加而減小，還觀察到細(xì)胞形態(tài)隨濃度增加而縮小、皺縮。取濃度為10 μM的H10處理肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)及流式分析凋亡實(shí)驗(yàn)，觀察到H10可明顯抑制肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞的遷移及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明，楊梅素可通過(guò)抑制BRCA1-GADD45信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[12]；抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[13]。下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9活性抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；抑制PIM1和干擾PIM1/CXCR4的相互作用可有效抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移。下調(diào)YAP的表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)。根據(jù)楊梅素的抗腫瘤機(jī)制中，PI3K/Akt是誘導(dǎo)凋亡的明星途徑，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶是研究遷移的主要機(jī)制，楊梅素衍生物H10發(fā)揮抗腫瘤作用是否同楊梅素，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究在肺癌H460中，證實(shí)H10具有顯著的抗腫瘤作用，不僅影響H460細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，還可抑制細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)凋亡，其中誘導(dǎo)凋亡具有顯著結(jié)果。鑒于此，我們下一步將研究楊梅素衍生物H10在體外誘導(dǎo)凋亡的分子通路，由于H10可影響H460形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，因此我們可從此方面研究H10是否通過(guò)影響細(xì)胞膜蛋白的傳導(dǎo)激活其下游蛋白，引發(fā)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡。