何耀明， 李尚仁， 李曉平， 王成興， 譚群英， 梁偉俊， 周朝榮， 趙景林△

(江門市中心醫(yī)院 a.胃腸外科；b.乳腺外科，廣東 江門 529000)

結(jié)腸癌是常見惡性腫瘤，根據(jù)2014年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析報告[1]，結(jié)腸癌發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3位，每年新發(fā)病例數(shù)約37萬，每年因結(jié)直腸癌死亡患者18萬，位居第5位。隨著我國腸鏡檢查的逐漸普及，結(jié)直腸癌的病死率不但無顯著下降，而且高齡(≥65歲)患者病死率逐年上升,加上社會老齡化問題越來越嚴(yán)重，降低老年人結(jié)直腸癌病死率具有重要意義。腫瘤組織具有特殊的能量代謝特點，盡管在有氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞始終以糖酵解這種快速產(chǎn)生ATP的糖代謝方式為細(xì)胞生長、增殖提供能量，即著名的Warburg效應(yīng)[2]。目前多認(rèn)為，糖酵解相關(guān)基因[如缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)[3]、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(GLUT-1)[4]、己糖激酶2(HK-2)[5]等]在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增加，基因[如GLUT-1、乳酸脫氫酶(LDH-A)、丙酮酸激酶同工酶2(PKM2)等]在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤中比原發(fā)灶有更高表達(dá)[6]，均提示糖酵解相關(guān)基因與結(jié)腸癌發(fā)生、進(jìn)展有重要作用。早發(fā)現(xiàn)、早治療、早干預(yù)可降低結(jié)腸癌病死率，若每個結(jié)直腸癌術(shù)后患者能縮短檢查周期，提早發(fā)現(xiàn)隱匿病灶并及時處理，對延長患者的生存率有重要意義，但過度檢查會造成醫(yī)療資源浪費，所以一個預(yù)測模型的應(yīng)用[7]，可將高危結(jié)腸癌患者區(qū)分開，從而有針對性地提早干預(yù)時間，是降低結(jié)直腸癌患者死亡的有效途徑之一。然而，目前針對老年結(jié)直腸癌患者預(yù)后預(yù)測模型的報道較少，因此，本研究根據(jù)糖酵解相關(guān)基因結(jié)腸癌發(fā)生、進(jìn)展的重要作用，基于TCGA結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫，確定與老年結(jié)直腸癌進(jìn)展的相關(guān)風(fēng)險基因及其相關(guān)系數(shù)，聯(lián)合各項臨床指標(biāo)，建立老年結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測模型，從而為高危老年結(jié)直腸癌患者提早干預(yù)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床資料(https://www.cancer.gov/) (Tomczak, Czerwinska & Wiznerowicz, 2015)。再進(jìn)一步從中篩選出年齡≥65歲的結(jié)直腸癌患者相關(guān)數(shù)據(jù)用作分析，其中包含癌旁或正常組織32例，腫瘤組織340例，用于生存分析包含完整隨訪信息的患者321例，糖酵解相關(guān)基因集通過MsigDB數(shù)據(jù)庫獲得(http://www.hmdb.ca)。包括BIOCARTA_GLYCOLYSIS_PATHWAY，GOBP_FRUCTOSE_1_6_BISPHOSPHATE_METABOLIC_PROCESS，HALLMARK_GLYCOLYSIS，GOMF_LACTATE_TRANSMEMBRANE_TRANSPORTER_ACTIVITY，GOBP_LACTATE_TRANSMEMBRANE_TRANSPORT，KEGG_GLYCOLYSIS_GLUCONEOGENESIS，MODULE_306，REACTOME_GLYCOLYSIS，WP_GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS 9個基因集。

1.2 方法

1.2.1 基因功能富集分析和差異分析獲得糖酵解差異表達(dá)基因 上述糖酵解基因集通過GSEA 4.1.0分析軟件進(jìn)行結(jié)直腸癌腫瘤組織和正常組織的基因富集分析，分析結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(NES)>1.5和P值(P<0.05)設(shè)定臨界值，獲得相關(guān)糖酵解基因集。 從相關(guān)糖酵解基因集中提取基因，在TCGA數(shù)據(jù)集提取患者糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)矩陣，表達(dá)矩陣使用“edgeR”包歸一化處理，使用Log2FC>1和錯誤發(fā)現(xiàn)率(fales discovery rate,FDR)<0.05作為臨界值，對腫瘤組織和正常組織相關(guān)糖酵解基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，獲得糖酵解差異表達(dá)基因。

1.2.3 風(fēng)險模型的效能驗證 由TCGA數(shù)據(jù)獲得的風(fēng)險模型，通過單因素COX回歸和多因素COX回歸明確獨立預(yù)后影響因子，包括：風(fēng)險分?jǐn)?shù)、性別、腫瘤分期、淋巴管浸潤、脈管浸潤。風(fēng)險模型的驗證分別在內(nèi)部臨床不同的亞組和外部GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)集GSE17536兩方面進(jìn)行，高低風(fēng)險組結(jié)果對比使用Kaplan-Meier生存分析，ROC曲線計算AUCs值，評估風(fēng)險模型的預(yù)測效能。

1.2.4 繪制列線圖 根據(jù)多因素COX回歸分析的結(jié)果，繪制分期，腫瘤位置(右側(cè)：升結(jié)腸、橫結(jié)腸；左側(cè)：結(jié)腸脾曲、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸)、分?jǐn)?shù)的列線圖，預(yù)測1、3、5 a的生存率，列線圖通過C-index和校準(zhǔn)圖，臨床決策曲線分析法，ROC曲線進(jìn)行預(yù)測效能驗證效能。

2 結(jié)果

2.1 老年結(jié)腸癌患者腫瘤組織和正常組織糖酵解相關(guān)基因集富集分析結(jié)果 通過GSEA富集分析9個糖酵解相關(guān)基因集發(fā)現(xiàn)，HALLMARK_GLYCOLYSIS和REACTOME_GLYCOLYSIS兩個基因集在老年結(jié)腸癌患者的腫瘤組織對比正常組織，糖酵解相關(guān)基因富集差異顯著。從這兩個顯著基因集中獲得糖酵解相關(guān)基因254個，再與老年結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)合并，得到老年結(jié)直腸癌糖酵解相關(guān)基因表達(dá)矩陣，進(jìn)行下一步基因差異表達(dá)分析。見表1，圖1。

表1 糖酵解基因集GSEA富集分析

注：A：HALLMARK_GLYCOLYSIS；B：REACTOME_GLYCOLYSIS圖1 腫瘤組織與正常組織GSEA富集分析結(jié)果

2.2 糖酵解差異表達(dá)基因結(jié)果 從老年結(jié)直腸癌腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)(340個腫瘤組織樣品和32個癌旁正常組織樣品)，結(jié)合獲得的254個糖酵解相關(guān)基因，以Log2FC>1和FDR<0.05作為臨界值進(jìn)行差異分析，獲得糖酵解差異基因46個，其中上調(diào)基因37個，下調(diào)基因9個。見圖2。

注：A：熱圖展示254個糖酵解相關(guān)基因在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況；B：火山圖展示老年結(jié)直腸癌腫瘤組織對比正常組織，37個基因顯著上調(diào)，9個基因顯著下調(diào)圖2 老年結(jié)直腸癌糖酵解相關(guān)基因在340個腫瘤組織和32個癌旁正常組織的表達(dá)差異分析

2.3 糖酵解基因風(fēng)險模型構(gòu)建

2.3.1 篩選預(yù)后相關(guān)糖酵解基因 結(jié)合老年結(jié)直腸癌患者生存資料及差異表達(dá)糖酵解基因的表達(dá)矩陣，使用COX單因素回歸方程，得到CAPN5、STC2、VEGFA、FKBP4、PKP2、NDC1、DEPDC1、COL5A1、TGFA、ANKZF1、GOT2 11個風(fēng)險相關(guān)基因，再根據(jù)LASSO回歸模型進(jìn)一步優(yōu)化，最終確認(rèn)模型風(fēng)險基因CAPN5、STC2、VEGFA、FKBP4、PKP2、NDC1、COL5A1、TGFA、ANKZF1、GOT2及其分子系數(shù)coefi。見圖3。

注：A：單因素COX回歸獲得11個預(yù)后風(fēng)險相關(guān)糖酵解基因；B-C：LASSO回歸進(jìn)一步優(yōu)化確定10個風(fēng)險相關(guān)基因及其分子系數(shù)圖3 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型

2.3.2 構(gòu)建風(fēng)險模型 根據(jù)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)量和對應(yīng)的分子系數(shù)，計算得出各個患者的風(fēng)險分?jǐn)?shù)，根據(jù)風(fēng)險分?jǐn)?shù)中位值將患者分為高風(fēng)險組及低風(fēng)險組，Kaplan-Meier生存分析提示高風(fēng)險組患者生存期顯著短于低風(fēng)險組，P=0.000 1，ROC曲線分析，1、3、5 a生存率的AUC值分別為0.705、0.730、0.674。見圖4。

注：A：根據(jù)患者風(fēng)險分?jǐn)?shù)由低到高排序分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組；B：高低風(fēng)險組患者生存狀態(tài)；C：高低風(fēng)險組糖酵解預(yù)后基因的表達(dá)；D：高低風(fēng)險組的Kaplan-Meier生存分析；E：ROC曲線圖4 預(yù)后風(fēng)險模型的構(gòu)建

進(jìn)行單因素和多因素COX回歸，評價老年結(jié)直腸癌的影響預(yù)后的獨立因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單因素COX回歸分析中，分期、脈管浸潤、淋巴管浸潤和風(fēng)險分?jǐn)?shù)是老年結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立因素，而在多因素COX回歸分析中，只有分期和風(fēng)險分?jǐn)?shù)是影響老年結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立因素。見圖5。

注：A：單因素COX回歸；B：多因素COX回歸圖5 影響老年結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立因素

2.4 風(fēng)險分?jǐn)?shù)模型效能外驗證 GEO數(shù)據(jù)GSE17536中年齡≥65歲患者進(jìn)行風(fēng)險模型外驗證，外驗證數(shù)據(jù)集中包括老年結(jié)直腸癌患者99例，根據(jù)TCGA老年結(jié)直腸癌風(fēng)險分?jǐn)?shù)中位數(shù)0.148 9作為臨界值，將外驗證數(shù)據(jù)集分為高風(fēng)險組46例，低風(fēng)險組53例。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析提示高風(fēng)險組患者生存期短于低風(fēng)險組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)。見圖6。

圖6 外驗證數(shù)據(jù)集GSE17536老年結(jié)直腸癌患者Kaplan-Meier生存分析

2.5 老年結(jié)直腸癌預(yù)測模型的構(gòu)建 根據(jù)COX回歸分析結(jié)果，基于患者風(fēng)險得分，淋巴管浸潤、脈管浸潤、T分期、N分期、M分期構(gòu)建列陣圖，預(yù)測老年結(jié)直腸癌患者1、3、5 a生存率。使用C-index，校準(zhǔn)曲線，ROC曲線，臨床決策曲線(DCA)評估列陣圖對老年結(jié)直腸癌患者的預(yù)測效能。預(yù)測模型C-index=0.730 48，校準(zhǔn)曲線與理想曲線相近，ROC曲線評價提示模型預(yù)測1、3、5 a生存率的AUC值分別為0.766、0.742、0.783。均提示模型具有良好的預(yù)測效能。見圖7。

注：A：構(gòu)建列陣圖預(yù)測老年結(jié)直腸癌患者生存率；B：預(yù)測模型的ROC曲線，預(yù)測1、3、5 a生存的AUC值分別是0.766、0.742、0.783；C：預(yù)測1、3、5 a生存率的校準(zhǔn)曲線；D-F：1、3、5 a生存預(yù)測模型的臨床決策曲線圖7 老年結(jié)直腸癌預(yù)測模型的構(gòu)建

3 討論

結(jié)直腸癌是我國常見惡性腫瘤，雖然其患者的病死率基本與以往相仿，但是老年(≥65歲)結(jié)直腸癌患者病死率卻逐年上升。腫瘤細(xì)胞具有特殊的代謝方式——Warburg效應(yīng)，盡管在有氧條件下，腫瘤細(xì)胞的能量代謝仍以產(chǎn)生能量更快的糖酵解方式為主，糖酵解是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要能量來源，而且目前多認(rèn)為，糖酵解相關(guān)基因與結(jié)腸癌患者的預(yù)后有重要聯(lián)系。因此，基于腫瘤的糖酵解代謝特征，本研究建立了老年結(jié)直腸癌糖酵解相關(guān)基因預(yù)后模型，有利于高危老年結(jié)直腸癌患者臨床決策確立，及早干預(yù)，延長老年結(jié)直腸癌患者生存期。

糖酵解相關(guān)基因的風(fēng)險分?jǐn)?shù)與腫瘤分期一樣，是老年結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨立影響因素，高風(fēng)險組患者，其生存率顯著低于低風(fēng)險組(P<0.001)，ROC曲線分析1、3、5 a生存率的AUC值分別是0.705、0.730、0.674，提示風(fēng)險分?jǐn)?shù)對老年1、3 a生存率有較好的預(yù)測效能，而對5 a生存率的預(yù)測效能一般，但當(dāng)結(jié)合相關(guān)臨床信息時，5 a生存率的AUC值提升至0.783，提示模型具有良好的預(yù)測效能。

目前對結(jié)直腸癌預(yù)后模型的使用報道不多，糖酵解相關(guān)基因預(yù)后模型更少見，曾有糖酵解相關(guān)基因結(jié)直腸癌預(yù)后模型的報道[8]，該模型主要建立在糖酵解預(yù)后不良上調(diào)基因的基礎(chǔ)上，前期利用相同方法建立老年人結(jié)直腸癌預(yù)后模型發(fā)現(xiàn)，該方法無法在外數(shù)據(jù)集中得到驗證，其中一個重要原因是TCGA數(shù)據(jù)庫主要使用二代測序方法，與GEO探針檢測方法存在本質(zhì)區(qū)別，基因表達(dá)量差距較大，僅以TCGA數(shù)據(jù)庫計算得出的由上調(diào)基因構(gòu)成的高低風(fēng)險臨界值難以應(yīng)用于外驗證集中。本研究根據(jù)COX單因素回歸方程所得風(fēng)險基因再通過LASSO回歸模型優(yōu)化最終獲得10個風(fēng)險相關(guān)基因，包括提示不良預(yù)后的STC2、VEGFA、FKBP4、COL5A1、TGFA、ANKZF1和良好預(yù)后的CAPN5、PKP2、NDC1、GOT2，由預(yù)后良好基因和預(yù)后不良基因及其分子系數(shù)coefi共同計算得出風(fēng)險分?jǐn)?shù)可應(yīng)用于GEO數(shù)據(jù)集，具有良好的預(yù)測效能。

VEGFA編碼血管內(nèi)皮生長因子α，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中血管生成[9]，與結(jié)腸癌腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]，而STC2編碼一種分泌型同型二聚體糖蛋白，參與調(diào)節(jié)多種蛋白活化相關(guān)，目前認(rèn)為與結(jié)腸癌腫瘤大小、血管浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分化等多種病理臨床指標(biāo)具有相關(guān)性[11]，也有研究[12]認(rèn)為，與轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌VEGFR靶向治療耐藥相關(guān)。FKBP4是熱休克蛋白90的共同伴侶分子， ANKZF1編碼為鋅指肽基TRNA水解酶，通常在細(xì)胞應(yīng)激的狀態(tài)下，F(xiàn)KBP4、ANKZF1均表達(dá)增加，維持線粒體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性[13-14]。FKBP4在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達(dá)增加[15]，有研究[16-17]表明，F(xiàn)KBP4表達(dá)的增強與乳腺癌、肺癌進(jìn)展，預(yù)后不良相關(guān)，ANKZF1高表達(dá)提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良[18]。TGFA，編碼變形生長因子alpha，是EGFR的重要配體之一，能激活EGFR，調(diào)節(jié)上皮—間質(zhì)遷移，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[19]。COL5A膠原蛋白成員，參與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，在乳腺癌、卵巢癌、肺癌及腎癌及中高表達(dá)，COL5A表達(dá)增加與預(yù)后不良相關(guān)[20]。PKP2屬于斑菲素蛋白Plakophilins (PKPs)家族，能與蛋白激酶C結(jié)合相關(guān)，PKP2是Wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄目標(biāo)，可負(fù)反饋Wnt/β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，抑制腫瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的過度激活[21]。而關(guān)于CAPN5、NDC1、GOT2在腫瘤中的作用報道很少，作用機制還有待進(jìn)一步闡明。

本研究也存在一定的局限性，首先，文中的預(yù)測模型缺少患者的化療、放療、免疫治療等治療信息，可能會對預(yù)測效能造成一定影響；其次，本研究是基于生物信息學(xué)的分析，風(fēng)險基因的相關(guān)功能與機制研究還有待于進(jìn)一步明確。總之，本研究基于糖酵解相關(guān)風(fēng)險基因建立的預(yù)測模型對老年結(jié)直腸癌患者預(yù)后有良好預(yù)測效能。