徐 璐，關(guān)立增，魏明吉，張 晴，劉涵笑，馮子睿

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

弓形蟲(chóng)（T. gondii）是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，感染包括人在內(nèi)的大部分溫血?jiǎng)游?，世界上約三分之一人口感染了弓形蟲(chóng)[1]。畜禽感染率高于人類(lèi)，我國(guó)豬弓形蟲(chóng)感染率在30%～50%，在一些地區(qū)甚至高達(dá)70%；我國(guó)西北部和北部地區(qū)綿羊弓形蟲(chóng)感染率達(dá)20%；我國(guó)南部地區(qū)超過(guò)20%雞感染弓形蟲(chóng)[2]。豬感染弓形蟲(chóng)后出現(xiàn)體溫升高、精神萎靡、采食量下降、被毛蓬亂，嚴(yán)重者后肢無(wú)法正常站立、呼吸不順、咳嗽、下痢等。懷孕母豬往往會(huì)流產(chǎn)或產(chǎn)出死胎。弓形蟲(chóng)對(duì)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展的潛在威脅引起越來(lái)越多的關(guān)注。

弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致宿主多器官損傷，腦和脊髓是弓形蟲(chóng)感染的主要靶器官[3]。弓形蟲(chóng)造成肝臟腫大、肝炎、肝臟肉芽腫、肝壞死、膽汁淤積性黃疸和肝硬化等臨床癥狀[4]。在多項(xiàng)研究中，山羊、犬、兔子、豬、公牛和人類(lèi)精液中可檢測(cè)到弓形蟲(chóng)。最近一項(xiàng)關(guān)于男性不育患者弓形蟲(chóng)感染的調(diào)查顯示，在100 例男性不育患者中，6%患者血清弓形蟲(chóng)IgG、IgM 和CAG呈陽(yáng)性[5]。弓形蟲(chóng)感染造成雄性生殖損傷，但損傷作用機(jī)制尚不明確。本研究采用弓形蟲(chóng)RH 株感染雄性BALB/c 小鼠，探究弓形蟲(chóng)感染對(duì)雄性小鼠生殖功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 弓形蟲(chóng)RH 株由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)國(guó)家原蟲(chóng)病研究中心提供，由臨沂大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存，在小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)傳代；SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；睪酮（Testosterone，T）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA 試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒自南京建成生物有限公司；腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素1beta（Interleukin-beta，IL-1β）ELISA 試劑盒購(gòu)自Biolegend 公司；精子活體染色液購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；RIPA 裂解液、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（顯色法）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠B 淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bax）多克隆抗體、兔抗鼠β-Actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（IgG-HRP）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將雄性BALB/c 小鼠分為2 組（n=12）：弓形蟲(chóng)感染組和對(duì)照組，感染組小鼠腹腔注射弓形蟲(chóng)（RH株，103個(gè)/只），0.2 mL/只，對(duì)照組小鼠注射等量生理鹽水。感染后7 d，眼球采血，頸椎脫臼迫殺小鼠，取睪丸及附睪用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 小鼠生殖參數(shù)測(cè)定 取小鼠左附睪置于裝有PBS（pH7.4）平皿上，剪碎，在37 ℃恒溫箱中孵育30 min，伊紅染液染色，測(cè)定精子密度。顯微鏡下觀察精子形態(tài)，精子形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)（圖1）：（1）正常精子：形似蝌蚪、精子頭光滑、頂體清楚、精子各部分無(wú)明顯畸形；（2）精子畸形包括：頭部無(wú)鉤、胖頭、雙頭、無(wú)定形頭、香蕉頭，中部殘余胞漿、彎曲畸形，尾部鞭毛缺失、雙尾、短尾等。

圖1 精子畸形模式圖Fig.1 Pattern of sperm malformation

1.4 小鼠睪丸組織病理學(xué)觀察 各組小鼠睪丸組織置于10%中性福爾馬林固定后，包埋，制備石蠟切片，HE 染色后經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 小鼠血清生殖激素和細(xì)胞因子測(cè)定 小鼠眼球采血后，分離血清，采用相應(yīng)ELISA 試劑盒測(cè)定各組小鼠血清中T、LH、FSH、TNF-a、IL-6 及IL-1β表達(dá)量。

1.6 小鼠睪丸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 取各組小鼠睪丸組織，研磨后，于8 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清液，利用相應(yīng)試劑盒測(cè)定各組小鼠睪丸組織中MDA、NO、GSH 及SOD 表達(dá)量。

1.7 小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的TUNEL 檢測(cè) 取小鼠睪丸組織按常規(guī)方法制做石蠟切片，滴加蛋白酶K，于37 ℃恒溫箱中放置30 min，用PBS 將蛋白酶K 洗凈。將3%過(guò)氧化氫溶液滴到石蠟切片上，覆蓋樣品，防止過(guò)氧化物酶造成干擾，用混勻后的生物素標(biāo)記液（TdT 酶、Biotin-Dutp、生物素標(biāo)記液）于37 ℃恒溫箱中避光孵育樣本。將TUNEL 檢測(cè)液滴到石蠟切片上，覆蓋樣品，于37 ℃恒溫箱中避光孵育樣本，30 min 后用PBS 洗滌，加Streptavidin-HRP 孵育，DAB 顯色，蘇木素染細(xì)胞核，封片，利用顯微鏡觀察睪丸細(xì)胞凋亡情況。

1.8 睪丸細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的western blot 檢測(cè)各組小鼠睪丸組織經(jīng)RIPA 裂解后，分別以兔抗鼠Bax 多克隆抗體（1：1 000）、兔抗鼠Bcl-2 單克隆抗體（1：1 000）、兔抗鼠β-Actin 多克隆抗體（1：2 000）為一抗，山羊抗兔IgG-HRP（1：3 000）為二抗，ECL 顯色，利用圖像分析軟件（Bio-Rad、Richmond、CA、USA）分析條帶灰度，通過(guò)western blot 分析小鼠睪丸細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 的表達(dá)水平。

1.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行單因素ANOVA 方差分析，LSD 法多重比較，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠生值參數(shù)和組織學(xué)改變的影響 將弓形蟲(chóng)RH 株感染雄性小鼠7 d 后，迫殺取附睪，處理并染色后經(jīng)顯微鏡觀察精子狀態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠精子密度為（27.89±4.88）×106個(gè)/mL，精子畸形率為（3.36%±0.49）%，感染組小鼠精子密度為（14.57±2.36）×106個(gè)/mL， 精子畸形率為（5.22 ±0.86）%。與對(duì)照組比較，感染組小鼠精子密度顯著下降（P＜0.01），精子畸形率顯著增加（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，弓形蟲(chóng)感染組小鼠睪丸組織發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為睪丸細(xì)胞數(shù)量減少、變性、排列紊亂、細(xì)胞間隙增大等嚴(yán)重病理改變。對(duì)照組小鼠睪丸組織各層生精細(xì)胞均正常（圖2）。結(jié)果表明，弓形蟲(chóng)降低了小鼠生精能力及造成小鼠睪丸組織的病理?yè)p傷。

圖2 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠睪丸組織的病理?yè)p傷（200×）Fig.2 The effect of Toxoplasma gondii on the pathological damage of testis in male mice(200×)

2.2 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠生殖激素影響 睪丸支持細(xì)胞分泌的FSH 在睪丸發(fā)育中起重要作用。LH 通過(guò)與促黃體生成素受體（LHR）結(jié)合，促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖，增加T 分泌。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，弓形蟲(chóng)導(dǎo)致小鼠血清性激素（FSH、 LH、T）水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）（圖3）。表明弓形蟲(chóng)感染造成小鼠血清性激素下降。

圖3 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠生殖激素的影響Fig.3 Effect of Toxoplasma gondii on reproductive hormones in male mice

2.3 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠血清細(xì)胞因子分泌的影響TNF-α、IL-6 和IL-1β 等細(xì)胞因子在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，利用ELISA 法測(cè)定弓形蟲(chóng)感染后的小鼠血清中的這些細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，感染組小鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平較對(duì)照組極顯著升高（P＜0.01）（圖4）。表明弓形蟲(chóng)感染引起小鼠血清內(nèi)炎性細(xì)胞因子的增加。

圖4 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠血清細(xì)胞因子影響Fig.4 Effect of Toxoplasma gondii on serum cytokines in male mice

2.4 弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響氧化應(yīng)激對(duì)精子的發(fā)生有重要影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，感染組小鼠睪丸組織內(nèi)MDA、NO 表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），SOD、GSH 表達(dá)量極顯著減少（P＜0.01）（圖5）。表明弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致小鼠睪丸細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。

圖5 弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠睪丸組織MDA、SOD、GSH和NO影響Fig.5 Effects of Toxoplasma gondii on MDA,SOD,GSH and NO in testis of mice

2.5 弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響 弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡，采用TUNEL 法檢測(cè)睪丸細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，感染組小鼠睪丸細(xì)胞觀察到大量TUNEL 陽(yáng)性凋亡細(xì)胞（深棕色），且睪丸細(xì)胞凋亡率為（11.28±1.58）%，對(duì)照組小鼠睪丸細(xì)胞凋亡率為（2.32±0.37）%，二者差異極顯著（P＜0.01）（圖6）。表明弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致小鼠睪丸細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖6 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響（400×）Fig.6 Effect of Toxoplasma gondii on testicular cell apoptosis in male mice(400×)

2.6 弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響凋亡蛋白Bax 和Bcl-2 在細(xì)胞凋亡中具有重要調(diào)節(jié)作用。本研究采用western blot 法測(cè)定睪丸組織中Bax 和Bcl-2 的表達(dá)量來(lái)分析弓形蟲(chóng)造成小鼠睪丸細(xì)胞凋亡作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，感染組小鼠睪丸中Bax 蛋白表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖7）。表明弓形蟲(chóng)能促進(jìn)小鼠睪丸促凋亡蛋白分泌從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖7 弓形蟲(chóng)對(duì)雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Toxoplasma gondii on the expression of apoptosis protein in testis of male mice

3 討 論

精子是成年雄性睪丸中產(chǎn)生的高度特化單倍體細(xì)胞，精子形成過(guò)程是指精子在睪丸曲細(xì)精管腔內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的成熟和轉(zhuǎn)化過(guò)程。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，精子密度、運(yùn)動(dòng)性、活力和異形率等指標(biāo)用于評(píng)估精子功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)感染小鼠的精子密度降低和精子畸形率增加，說(shuō)明弓形蟲(chóng)感染降低雄性小鼠的生精功能。

下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)雄性動(dòng)物生殖活動(dòng)的不同階段，例如性行為、精子形成和精子成熟等。弓形蟲(chóng)對(duì)雄性動(dòng)物生殖功能損害可能通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸從而影響睪丸和精細(xì)胞性激素產(chǎn)生[7]。弓形蟲(chóng)感染降低垂體對(duì)促性腺激素釋放激素（GnRH）的刺激敏感性。GnRH 變化直接影響FSH 和LH 的合成和釋放。FSH 由睪丸支持細(xì)胞分泌，在睪丸發(fā)育中起重要作用。LH 與受體結(jié)合促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖和增加T 的分泌[8]。這些雄性激素具有很多生理功能，例如維持精子發(fā)生、促進(jìn)生殖器官發(fā)育、維持雄性動(dòng)物正常性功能和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成等。弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物的睪酮水平下降。急性弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致雄性和雌性小鼠血清T 含量下降[9]。在高劑量弓形蟲(chóng)感染的雄性大鼠中，大鼠血清和睪丸的T 短暫降低[10]。在急性弓形蟲(chóng)病期間，男性患者的總睪酮和游離睪酮、FSH 和LH 水平均降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)感染的小鼠體內(nèi)T、FSH 和LH 含量顯著降低，與以上結(jié)果一致。弓形蟲(chóng)感染宿主過(guò)程中涉及促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)的失衡。TNF-α、IL-1β 和IL-6 是常見(jiàn)的促炎細(xì)胞因子，高水平的TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)提示炎癥發(fā)生。該研究顯示，弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致雄性小鼠炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加。因而，糾正下丘腦-垂體-性腺軸功能障礙和抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)可預(yù)防弓形蟲(chóng)病導(dǎo)致的睪丸功能障礙。

睪丸氧化應(yīng)激發(fā)生對(duì)精子發(fā)生和男性生育能力有不利影響，并伴隨著一些促氧化和抗氧化生物標(biāo)志物如MDA、SOD、GSH 和NO 的變化。MDA 是多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物[12]。弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致MDA 含量顯著增加[13]。在感染弓形蟲(chóng)過(guò)程中，SOD 和GSH 是抗氧化損傷和產(chǎn)生活性氧的兩種關(guān)鍵酶[12-13]。NO 是一種由一氧化氮合酶產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，廣泛分布于睪丸生精小管中[14]。在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中，睪丸內(nèi)NO 表達(dá)的增高會(huì)增加其的氧化應(yīng)激[15]。本研究表明，弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致小鼠睪丸MDA 和NO 升高，SOD 和GSH 降低。提示弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致小鼠睪丸細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激。

弓形蟲(chóng)感染能引起宿主細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道，弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致宿主CD4+T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞凋亡[16]。急性弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致小鼠脾臟發(fā)生細(xì)胞凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)能引起睪丸細(xì)胞凋亡，其可能的機(jī)制是：雄性小鼠感染弓形蟲(chóng)后，睪丸內(nèi)生精細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌TNF-α 從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；睪丸內(nèi)游離氧化自由基與多聚不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)從而引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物等可以引發(fā)睪丸生精細(xì)胞凋亡；弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中雄性激素（T、LH 和FSH）含量降低從而導(dǎo)致睪丸生精細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2 家族起重要作用[18]。線(xiàn)粒體依賴(lài)性凋亡通路激活由Bcl-2 家族蛋白調(diào)控。Bcl-2 基因主要功能是增強(qiáng)細(xì)胞抵抗外界凋亡刺激因素[19]。Bax 基因從細(xì)胞質(zhì)到線(xiàn)粒體易位誘導(dǎo)細(xì)胞色素c 釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 與Bax 能形成同源或異源二聚體從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。Western blot 結(jié)果顯示，感染組小鼠睪丸組織Bax 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加，而B(niǎo)cl-2 蛋白表達(dá)量無(wú)顯著性差異。說(shuō)明弓形蟲(chóng)感染造成的小鼠生精細(xì)胞凋亡可能由于通過(guò)促進(jìn)Bax 蛋白表達(dá)，導(dǎo)致Bcl-2 和Bax 同源二聚體比例增加，異源二聚體比例降低。

本研究首次證實(shí)了弓形蟲(chóng)感染可引起雄性小鼠生殖參數(shù)改變、炎性細(xì)胞因子表達(dá)量增加、睪丸細(xì)胞氧化應(yīng)激、睪丸細(xì)胞凋亡等。由于小鼠是弓形蟲(chóng)研究的最佳模型，本研究結(jié)果為弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致人及動(dòng)物生殖障礙機(jī)制研的究奠定基礎(chǔ)。