高艷飛，王尚輝，王海偉，孫明霞，潘 力，肖培宇，蔡雪輝，涂亞斌

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease，PCVD）在全球范圍內(nèi)廣泛流行，各生長(zhǎng)階段的豬均易發(fā)該病，因其致病性高、傳染性強(qiáng)、能夠引起嚴(yán)重的免疫抑制等特點(diǎn)，嚴(yán)重阻滯了全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是導(dǎo)致PCVD 的主要病原，其對(duì)環(huán)境的耐受力強(qiáng)，對(duì)氯仿不敏感，在56 ℃或70 ℃均能夠存活一段時(shí)間。PCV2 無(wú)血凝性，其遺傳物質(zhì)為單股負(fù)鏈、共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA[1-2]。PCV2 的環(huán)狀DNA 中存在開(kāi)放閱讀框ORF2，其編碼的衣殼（Cap）蛋白是PCV2 主要的保護(hù)性抗原[3]，也是基因工程疫苗研究的主要靶蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)PCV2 的8 個(gè)基因亞型， 分別為PCV2a～PCV2h[4]。PCV2a、PCV2b、PCV2d 是PCV2 的3 種主要基因亞型，其中PCV2d 的致病性較強(qiáng)[5-6]。

目前防控該病的主要策略是合理接種疫苗，然而商品化的疫苗多為滅活疫苗，存在免疫效果差、免疫次數(shù)多、生產(chǎn)成本高、研發(fā)周期長(zhǎng)、免疫保護(hù)期短等缺陷，且研究表明當(dāng)前PCV2 變異迅速[7]，這些問(wèn)題給PCVD 的防控帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，而經(jīng)濟(jì)、安全、穩(wěn)定和制備快速的基因工程疫苗是當(dāng)前PCVD疫苗研究的熱點(diǎn)，其能夠規(guī)避滅活疫苗的部分缺點(diǎn)，為更好地防控PCVD 提供了可能，但仍然存在一些問(wèn)題及不足。本文概述了PCVD 基因工程疫苗的種類、優(yōu)缺點(diǎn)及相關(guān)研究進(jìn)展等，旨在為該病基因工程疫苗的研發(fā)積累參考資料，為高效PCVD 基因工程疫苗的研發(fā)提供思路。

基因工程疫苗是利用DNA 重組技術(shù)，于細(xì)菌、酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等中定向插入人工合成的或天然的目的基因，使之充分表達(dá)，并經(jīng)一系列工藝操作后制備的疫苗或利用基因工程技術(shù)敲除病原的相關(guān)毒力基因后制備而成。利用基因工程技術(shù)能夠研制出亞單位疫苗、基因缺失疫苗、嵌合病毒疫苗、DNA 疫苗、活載體疫苗、標(biāo)記疫苗等。表1 為目前主要的商品化PCVD 基因工程疫苗的類型。

表1 目前主要的商品化PCVD基因工程疫苗的類型

1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是將病原的免疫保護(hù)性相關(guān)基因克隆到合適的表達(dá)載體中，在體外高效表達(dá)保護(hù)性抗原，經(jīng)過(guò)一系列工藝處理后，獲得的一種疫苗[8]。上世紀(jì)80 年代為了防控乙型肝炎，科學(xué)家們利用基因重組技術(shù)，在其他生物中首次成功表達(dá)了乙肝疫苗抗原—HBsAg，使得乙肝疫苗能夠規(guī)?；a(chǎn)，對(duì)乙型肝炎的防控起到了關(guān)鍵性作用。后來(lái)有研究者利用基因工程技術(shù)成功研制出了PCVD 亞單位疫苗，目前PCVD 亞單位疫苗包括常規(guī)亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和嵌合病毒樣顆粒疫苗。

1.1 常規(guī)亞單位疫苗 常規(guī)亞單位疫苗常用的表達(dá)系統(tǒng)包括：桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母菌表達(dá)系統(tǒng)。YE 等構(gòu)建了PCV2 的BV-GD-ORF2 的桿狀病毒雙表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)能夠同時(shí)表達(dá)PCV2 的Cap 蛋白和皰疹性口腔炎病毒的糖蛋白（VSV-G），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該重組桿狀病毒接種后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[9]。Kim 等利用桿狀病毒（Bac）表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)PCV-2b、PCV-2d 的Cap 蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)的兩種Cap 蛋白均能有效保護(hù)目標(biāo)動(dòng)物[10]。常規(guī)亞單位疫苗僅有病毒的部分結(jié)構(gòu)蛋白，安全性高，但常規(guī)亞單位疫苗的抗原性與所選用的表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)，因此選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)是制備該類疫苗的關(guān)鍵。

1.2 病毒顆粒樣疫苗 病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLP）疫苗是一種新型亞單位疫苗，其僅有病毒的外殼蛋白而不含病毒遺傳物質(zhì)，且形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子相似，能夠誘導(dǎo)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[11]。迄今已有多種PCV2-VLP 疫苗被報(bào)道，根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的不同，可分為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)。

1.2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌作為最早用于表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，具有生長(zhǎng)迅速、表達(dá)量大、遺傳背景清晰、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是規(guī)?；苽浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且不需要額外修飾的重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)[12]，但大腸桿菌表達(dá)的外源蛋白，需要去除內(nèi)毒素，會(huì)造成目的蛋白的損失。Wu 等優(yōu)化了Cap 基因5'端帶有稀有精氨酸的密碼子，使其在大腸桿菌中能表達(dá)出自組裝成VLP 的全長(zhǎng)重組蛋白（CAP1-233），實(shí)驗(yàn)證明該VLP 能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)PCV2 的特異性免疫應(yīng)答[13]。Xi 等部分優(yōu)化了Cap蛋白的密碼子，將其定向插入表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，能夠大量表達(dá)Cap 蛋白，且此Cap 蛋白能在中性緩沖液中自組裝成VLP，免疫豬后證明其具有很好的免疫原性，是一種候選亞單位疫苗[14]。

1.2.2 桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)以糖基化、磷酸化等方式修飾外源蛋白，使表達(dá)的重組蛋白具有與天然病毒蛋白類似的結(jié)構(gòu)和活性，且有利于形成VLP，但相比于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白的成本高。He 等分別在大腸桿菌BL21 原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒感染的家蠶中表達(dá)帶有6×His 標(biāo)簽的Cap 蛋白，發(fā)現(xiàn)家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的Cap 蛋白在體外能夠自組裝成VLP，并且于透射電鏡（TEM）下觀察到了VLP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的VLP 具有良好的免疫原性，具備開(kāi)發(fā)成為高效疫苗的潛力[15]。Masuda 等利用蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模表達(dá)了PCV2-VLP，并成功建立了三步法分離純化重組衣殼蛋白（rCap）的簡(jiǎn)單方法，純化的rCap 自組裝成與原病毒形態(tài)相似的VLP，且生產(chǎn)的VLP 能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PCV2 的中和抗體[16]。

1.2.3 酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母生長(zhǎng)迅速、能夠大規(guī)模發(fā)酵，其既具有原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，又具有一定的修飾和翻譯后加工蛋白的能力，且該表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)⒛康牡鞍追置诘郊?xì)胞外，但是其分泌效率低。Duan等利用馬克斯克魯維酵母表達(dá)出能組裝成VLP 的Cap蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的IgG，并且降低了小鼠肝臟和脾臟中的病毒滴度[17]。Chen等利用釀酒酵母表達(dá)出大量可溶性的分泌于培養(yǎng)基中的Cap 蛋白，且能自組裝成VLP，表達(dá)產(chǎn)量較高，能夠作為PCVD 亞單位口服疫苗的候選疫苗[18]。

1.2.4 植物表達(dá)系統(tǒng) 目前已有多種植物能夠表達(dá)外源蛋白，包括煙草、大豆、水稻、玉米等。相比于其他表達(dá)系統(tǒng)，植物表達(dá)系統(tǒng)具有安全性高、生產(chǎn)成本低、表達(dá)的外源蛋白易于儲(chǔ)存和加工等優(yōu)點(diǎn)，且能夠正確翻譯和修飾外源蛋白，但植物表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低、免疫原性弱等諸多問(wèn)題。Park 等利用植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PCV2 重組Cap 蛋白，并利用親和層析法純化后，經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其在pH 值為中性時(shí)自組裝成了VLP，豚鼠實(shí)驗(yàn)證明該VLP 能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[19]。

VLP 疫苗與單一病毒抗原蛋白及多肽相比，其構(gòu)象表位類似于天然病毒的構(gòu)象表位，免疫原性良好，且不含病毒基因組，是安全高效的基因工程疫苗，但VLP 疫苗需要綜合考慮上游基因的構(gòu)建、表達(dá)系統(tǒng)的選擇、純化放大工藝的優(yōu)化及VLP 質(zhì)量鑒定的方法等因素。

1.3 嵌合病毒樣顆粒疫苗 嵌合病毒樣顆粒（Chimeric virus-like particles，cVLP）疫苗是將外源性抗原多肽利用化學(xué)方法偶聯(lián)VLP 或通過(guò)融合基因表達(dá)制備而成，是一種改良型的VLP[20-21]。cVLP 疫苗的應(yīng)用前景良好，迄今已有多種cVLP 疫苗被報(bào)道。PCVD 的cVLP 疫苗主要包括嵌合T 細(xì)胞表位的PCV2-VLP 和嵌合B 細(xì)胞表位的PCV2-VLP。嵌合通用T 細(xì)胞表位的PCV2-VLP 是利用基因工程技術(shù)于PCV2 的VLP 上表達(dá)多個(gè)T 細(xì)胞通用表位，其能夠增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)PCV2-VLP 的細(xì)胞免疫，從而減少佐劑的使用甚至替代佐劑，目前暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道嵌合通用T細(xì)胞表位的PCV2-VLP。嵌合B 細(xì)胞表位的PCV2-VLP 是將其他病原的B 細(xì)胞表位嵌合于PCV2-VLP中，使其能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多種病原的特異性免疫應(yīng)答，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了嵌合豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）和口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）B 細(xì)胞表位的PCV2-VLP[22-23]，該類cVLP 疫苗能夠?qū)崿F(xiàn)一針多防，減少動(dòng)物的免疫應(yīng)激，且節(jié)省人力物力。但需要注意的是高效免疫表位和表達(dá)載體的選擇是cVLP 疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，也是其設(shè)計(jì)的最大障礙。

亞單位疫苗不含病原感染性物質(zhì)，其能夠避免弱毒疫苗毒力返強(qiáng)、滅活疫苗滅活不完全等的潛在風(fēng)險(xiǎn)，為開(kāi)發(fā)出新型PCV2 疫苗提供了思路，但目前商品化的PCV2 亞單位疫苗大多由桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，盡管Cap 蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中能夠自組裝成VLP，且免疫原性良好，但利用該表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)VLP 的效率低、成本高。因此為了克服桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的不足，實(shí)現(xiàn)VLP 疫苗的高效規(guī)模化生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)室利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研制出低成本、高產(chǎn)量、高純度和高密度的PCV2-VLP 疫苗，并且建立了高效去除內(nèi)毒素和PCV2-VLP 質(zhì)量控制的方法，免疫豬后的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該疫苗能夠有效保護(hù)豬免受野毒的攻擊，目前該產(chǎn)品已接近商品化，對(duì)于防控PCVD 意義重大，圖1 為本實(shí)驗(yàn)室規(guī)模化制備的PCV2-VLP 電鏡照片。

圖1 PCV2-VLP原液與PCV2-VLP原液稀釋20倍

2 PCV1/2 嵌合病毒疫苗

嵌合病毒疫苗是指通過(guò)改造病原體的基因組，即以不同的形式置換或連接兩種或多種病原體的基因組或片段，構(gòu)建出表達(dá)不同病原的重組基因，通過(guò)一些操作后，制備成傳統(tǒng)疫苗或基因工程疫苗。有研究者利用PCV1 的ORF2 基因置換PCV2 的ORF2基因，構(gòu)建出嵌合的PCV1/2 病毒株，經(jīng)處理后制成PCV1/2 嵌合病毒疫苗。該嵌合疫苗包括嵌合病毒弱毒苗和嵌合病毒滅活苗。Liu 等向缺失PCV1 ORF2 的pSKk-PCV1ΔORF2 中插入PCV2 ORF2，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)免疫組14 d 后，就有部分小鼠產(chǎn)生了PCV-2 Cap蛋白的中和抗體，表明該嵌合病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗體[24]。Li 等評(píng)價(jià)了2b 和2d 兩種基因亞型的嵌合病毒滅活苗的免疫效果，證實(shí)了這兩種嵌合病毒滅活苗均能夠?qū)ωi提供相應(yīng)的免疫保護(hù)[25]。Hemann 等評(píng)價(jià)了PCV1/2 嵌合病毒滅活苗和減毒活疫苗的免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明兩種疫苗均能夠降低育齡動(dòng)物的病毒血癥水平，但兩種疫苗均不能阻止病毒的垂直傳播[26]。

PCV1/2 嵌合病毒活疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，但存在疫苗毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，PCV1/2 嵌合病毒滅活苗安全性和免疫效果均較好，但存在滅活不徹底的潛在風(fēng)險(xiǎn)，且生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，成本高。盡管目前已有商品化的PCV1/2 嵌合病毒滅活苗，但由于其價(jià)格昂貴，不利于PCVD 的防控。

3 DNA 疫苗

DNA 疫苗是將病原的相關(guān)抗原基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒，將其注射動(dòng)物體后，表達(dá)出專一性的抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)抗原的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[27]。最早的DNA 疫苗是編碼流感病毒抗原蛋白的DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠保護(hù)小鼠免受流感病毒的攻擊。單繼艷等將H7N9 亞型禽流感病毒HA 基因的質(zhì)粒免疫雞，攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該質(zhì)粒能夠保護(hù)雞免受流感病毒的侵襲[28]。后續(xù)有研究者設(shè)計(jì)了能夠表達(dá)Cap 蛋白的質(zhì)粒，F(xiàn)u 等構(gòu)建了在293T 細(xì)胞中高效表達(dá)的質(zhì)粒PCV2-Cap 和PCV2-Ub-Cap，小鼠實(shí)驗(yàn)證明PCV2-Ub-Cap 的免疫效果優(yōu)于PCV2-Cap[29]。Syllas 等利用構(gòu)建的DNA 疫苗pEGFP-Cap 免疫小鼠，結(jié)果顯示，與未免疫組相比，免疫組小鼠的病毒載量明顯降低，且臨床癥狀和病理變化均明顯減輕[30]。

DNA 疫苗的免疫保護(hù)期長(zhǎng)、能夠誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）應(yīng)答，且易于構(gòu)建，然而DNA 疫苗的免疫效果與其入核的效率密切相關(guān)，因此需要選擇合適的遞送載體，以提高DNA 疫苗的遞送效率，進(jìn)而增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫效果，然而DNA疫苗存在與體內(nèi)基因組整合的潛在風(fēng)險(xiǎn)和免疫后可能引發(fā)免疫耐受等諸多問(wèn)題難以解決[31]，所以PCV2的DNA 疫苗尚處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段。

4 活載體疫苗

利用基因工程技術(shù)將病原抗原基因插入活載體中構(gòu)建的疫苗為活載體疫苗，根據(jù)重組載體的不同，主要包括重組細(xì)菌活載體疫苗和重組病毒活載體疫苗兩大類[32-33]。活載體疫苗最早是以痘病毒為活載體研發(fā)出來(lái)的基因工程疫苗，痘病毒基因組大，對(duì)插入外源性基因的耐受力強(qiáng)，能夠同時(shí)插入多個(gè)外源基因，且表達(dá)水平高，具有開(kāi)發(fā)成為多聯(lián)疫苗的潛力。活載體疫苗自問(wèn)世以來(lái)備受研究者的青睞，迄今已有多種PCV2 活載體疫苗被報(bào)道。

4.1 重組細(xì)菌活載體疫苗 Zhang 等構(gòu)建了一種可以口服的重組枯草芽孢桿菌的PCV2 疫苗，該疫苗比滅活的PCV2 能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性免疫反應(yīng)，是一種有潛力的候選疫苗[34]。Kim 等將PCV2-ORF2 基因片段克隆到aroA基因突變后的毒力減弱的博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica，BBS）中，獲得了能夠高效表達(dá)PCV2 Cap 蛋白的重組博德特氏菌（BBS-MCP），通過(guò)呼吸道將該重組菌免疫豬，攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫豬能夠抵抗PCV2 強(qiáng)毒的攻擊[35]。

4.2 重組病毒活載體疫苗 Li 等構(gòu)建了重組Cap 蛋白的腺病毒Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W，其能分泌表達(dá)Cap 蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組腺病毒能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，同時(shí)顯著降低了豬血液和組織中的PCV2 載量，免疫組攻毒后未出現(xiàn)明顯病理變化，其免疫效果優(yōu)于商品化的PCV2 滅活苗（SH）[36]。Tao 等設(shè)計(jì)了一種同時(shí)表達(dá)PCV2 Cap蛋白和豬肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MHP）P97R1P46P42 蛋白的重組桿狀病毒，分別成功表達(dá)了固定于桿狀病毒囊膜及細(xì)胞質(zhì)膜上的Cap 蛋白和P97R1P46P42 蛋白，實(shí)驗(yàn)證明該重組疫苗與混合商品疫苗的免疫效果相當(dāng)[37]。Wu 等在偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）中插入PCV2 ORF2 基因，構(gòu)建了高效表達(dá)Cap 蛋白的PRV 二聯(lián)疫苗，該二聯(lián)疫苗在小鼠和豬的實(shí)驗(yàn)中均誘導(dǎo)了高水平特異性抗體的產(chǎn)生[38]。

活載體疫苗免疫效果好、免疫保護(hù)期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本低、免疫方式簡(jiǎn)單、能夠同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)、能夠?qū)崿F(xiàn)一針多防、減少動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，且節(jié)省人力物力，然而所用的活載體對(duì)宿主存在潛在的安全性問(wèn)題，因此提高作為活載體微生物的安全性，是活載體疫苗研發(fā)的重要方向[39]。

5 標(biāo)記疫苗

標(biāo)記疫苗是指利用基因工程技術(shù)于病毒的基因組中插入分子標(biāo)簽，配合應(yīng)用相應(yīng)診斷技術(shù)可用于鑒別診斷的一種新型重組活疫苗，該疫苗免疫后能夠區(qū)分免疫豬和感染豬[40]。目前已有多種PCV2 標(biāo)記疫苗被報(bào)道。Beach 等分別構(gòu)建了攜帶兩種分子標(biāo)簽（GLU 和KT3）的PCV1/2 嵌合病毒，且證明這兩種嵌合病毒均能在PK15 細(xì)胞中增殖，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明它們能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生PCV2 的中和抗體以及針對(duì)分子標(biāo)簽KT3 或GLU 的抗體[41]。Huang 等構(gòu)建了攜帶分子標(biāo)簽V5 的重組PCV2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該病毒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PCV2 的中和抗體及V5 分子標(biāo)簽的抗體[42]。

研發(fā)高效安全的標(biāo)記疫苗與對(duì)應(yīng)的鑒別診斷技術(shù)，對(duì)于控制或根除動(dòng)物傳染病意義重大。由于目前PCV2 在全球范圍內(nèi)普遍流行，因此研發(fā)高效安全的PCV2 標(biāo)記疫苗與相應(yīng)的診斷鑒別技術(shù)，對(duì)于PCV2 的凈化具有重要意義。然而標(biāo)記的分子標(biāo)簽可能導(dǎo)致動(dòng)物接種后發(fā)生不良反應(yīng)，因此設(shè)計(jì)理想的分子標(biāo)簽以規(guī)避免疫動(dòng)物產(chǎn)生的不良反應(yīng)，則PCV2標(biāo)記疫苗將會(huì)有廣闊的發(fā)展前景。

6 小結(jié)與展望

盡管目前商品化疫苗的抗原類型主要為PCV2a和PCV2b，但該類疫苗能夠?yàn)槊庖邉?dòng)物提供抵抗大多數(shù)其他PCV2 亞型攻擊的能力[43]。然而隨著PCV2的不斷發(fā)變異，將導(dǎo)致目前疫苗的免疫保護(hù)效果下降[44]，且滅活疫苗的副反應(yīng)大、免疫保護(hù)期短、研發(fā)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)病毒的滴度低等缺點(diǎn)難以克服，因此迫切需要研發(fā)出高效、安全、廉價(jià)、可迅速應(yīng)對(duì)病毒變異的PCVD 基因工程疫苗。霧化吸入式疫苗是指通過(guò)霧化吸入方式接種的疫苗。該類疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫及黏膜免疫三重保護(hù)，其免疫方式簡(jiǎn)單，免疫應(yīng)激反應(yīng)小，對(duì)防治豬呼吸道傳染病意義重大，該類疫苗研發(fā)的難點(diǎn)在于抗原表達(dá)系統(tǒng)的選擇、抗原的霧化及吸入抗原劑量的把控，目前僅有新冠霧化吸入式疫苗被批準(zhǔn)附條件上市，而霧化吸入式PCVD 疫苗暫無(wú)報(bào)道。綜上，研制霧化吸入式疫苗、cVLP 疫苗、標(biāo)記疫苗及活載體疫苗均可用于PCVD 的防控，但這些疫苗仍有諸多困難亟待克服。

新冠肺炎疫情暴發(fā)以來(lái)，多種疫苗研發(fā)的技術(shù)路線同時(shí)進(jìn)行，其中新型疫苗mRNA 疫苗備受關(guān)注，目前已有兩款針對(duì)新型冠狀病毒的mRNA 疫苗被批準(zhǔn)上市，mRNA 疫苗是將相關(guān)RNA 在體外修飾后，通過(guò)遞送載體使其穿透脂質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，進(jìn)而使機(jī)體細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白，能夠同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[45]。與傳統(tǒng)疫苗相比，mRNA 疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、研發(fā)快速、生產(chǎn)成本低、外源基因不存在整合至宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但其存在運(yùn)輸存儲(chǔ)條件苛刻且技術(shù)較新等缺點(diǎn)[46-47]。隨著PCV2 的不斷變異，現(xiàn)有的商品化疫苗將不能對(duì)免疫豬提供很好的免疫保護(hù)，因此開(kāi)發(fā)針對(duì)PCV2 變異株的mRNA 疫苗對(duì)于PCVD 的防控也是一個(gè)新途徑。