石 博，侯美佳，孫思萌，劉嘉利，董秀梅,2，楊 巍,2，張 萍,2，師東方,2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)東北科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，黑龍江 哈爾濱 150030）

大腸埃希菌（Escherichia coli），又稱大腸桿菌，常引起腹瀉和敗血癥，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起犢牛腹瀉和死亡的原因之一，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[1]。ETEC 分泌的不耐熱腸毒素（Heat labile enterotoxin，LT）主要有兩種類型：由攜帶遺傳因子的質(zhì)粒編碼產(chǎn)生的LT-I（或LT1）和由染色體編碼產(chǎn)生的LT-II（或LT2），LT2 多見于牛源ETEC[2]。

目前對(duì)LT 的研究多集中于將LT1 制成疫苗或免疫佐劑[3]，由于ETEC 腸毒素的毒性作用而限制了其直接用于口服疫苗或天然免疫佐劑[4]，因此通過對(duì)腸毒素關(guān)鍵氨基酸的突變，構(gòu)建低毒性并保持其免疫原性的突變菌株是目前研制腸毒素疫苗和免疫佐劑的主要方式。然而目前對(duì)LT2的研究較少，多為對(duì)其無毒性的B 亞基免疫佐劑功能的研究[5-6]，如若利用LT2作為疫苗抗原或免疫佐劑，必須先降低其毒性，A亞基的ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性與其毒性密切相關(guān)，由計(jì)算機(jī)模擬的X 射線衍射LT 空間結(jié)構(gòu)顯示，與ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)的十幾個(gè)氨基酸集中于一個(gè)特定的區(qū)域[7-8]。LT2 A 亞基（LT2A）是其發(fā)揮毒素活性作用的關(guān)鍵亞基，因此本研究對(duì)LT2A 中影響LT2 毒性的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了初步篩選。

關(guān)于LT1 的研究較為深入，已有研究從LT1A 序列篩選出一些影響其毒性的氨基酸及其位點(diǎn)[9]。LT1A 和LT2A 的編碼基因（elt1A、elt2A）序列同源性較高，參照LT1A 的關(guān)鍵氨基酸及其位點(diǎn)，本研究對(duì)LT2A 6 個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了突變，并檢測了不同突變重組蛋白對(duì)鼠腎上腺皮質(zhì)瘤（Y1）細(xì)胞的毒性和對(duì)小鼠的免疫原性，初步篩選出顯著影響其毒性的關(guān)鍵氨基酸是LT2A 第95 位的纈氨酸（V），為LT2 毒性分子機(jī)制和大腸桿菌減毒疫苗的研究提供了科學(xué)信息和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌E. coliDN1502 株（LT2，F(xiàn)17）及質(zhì)粒pET-30a 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)傳染病學(xué)教研室保存；Y1 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；4 周齡SPF 級(jí)BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利與倫理規(guī)范。Trans 2K Plus DNA Marker、EasyTaq聚合酶、dNTPs、E. coliTrans-T1、E. coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Q5 高保真聚合酶購自NEB（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶SacI、XhoI，T4 DNA 連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 膠回收試劑盒購自Biomiga 公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TMB 顯色液、ECL plus 超敏發(fā)光液購自北京索萊寶科技有限公司；HisTrap 層析柱購自美國通用電氣（GE）公司；鼠抗His 標(biāo)簽單克隆抗體（MAb）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠IgG-HRP 購自納川生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；Prestained Protein Ladder 蛋白預(yù)染Marker 購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2elt2各突變基因的擴(kuò)增及各重組菌的構(gòu)建 參考E. coli影響LT1A 毒性氨基酸的相關(guān)研究[9]，通過對(duì)LT2A 與LT1A 氨基酸序列同源性分析，初步選擇了LT2A 的aa5、aa42、aa59、aa95、aa102 和aa110 6個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)镽5K、H42A、S59K、V95K、Y102K和E110K。參照GenBank 中elt2基因序列（JQ031705.1），利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增上述6 個(gè)位點(diǎn)突變基因的引物和1 對(duì)擴(kuò)增elt2基因的引物，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

以提取的E. coliDN1502 株DNA 為模板利用LT2-F/LT2-R 為引物PCR 擴(kuò)增elt2；以提取的E. coliDN1502 DNA 為模板，以LT2-F/R5K-R 為引物PCR擴(kuò)增aa5 突變的mLT2-R5K序列前段，以R5K-F/LT2-R 為引物PCR 擴(kuò)增aa5 突變的mLT2-R5K序列的后段，再以突變片段的前后段為模板，以LT2-F/LT2-R 為引物，采用重疊延伸PCR（SOE PCR）擴(kuò)增aa5 突變的mLT2-R5K全長序列； 按上述方法以提取的E. coliDN1502 DNA 為模板，以相對(duì)應(yīng)的引物分別經(jīng)SOE PCR 擴(kuò)增mLT2-E110K、mLT2-Y102K、mLT2-V95K、mLT2-S59K、mLT2-H42A序列，并由庫美生物科技有限公司測序，正確的序列雙酶切（SacI 和XhoI）后克隆于相同雙酶切后的pET-30a 載體，構(gòu)建相應(yīng)重組質(zhì)粒，并由雙酶切（SacI 和XhoI）方法鑒定。將鑒定正確的各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組大腸桿菌pET-30a-elt2/BL21、pET-30a-R5K/BL21、pET-30a-H42A/BL21、pET-30a-S59K/BL21、 pET-30a-V95K/BL21、 pET-30a-Y102K/BL21、pET-30a-E110K/BL21；將pET-30a 轉(zhuǎn)入BL21 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pET-30a/BL21作為后續(xù)試驗(yàn)的對(duì)照。

1.3 各重組蛋白的表達(dá)及鑒定 參照文獻(xiàn)[10]方法優(yōu)化蛋白表達(dá)條件，將重組菌在12 ℃、200 r/min，IPTG（終濃度為1.5 mmol/L）誘導(dǎo)條件下，振蕩培養(yǎng)20 h；利用HisTrap 層析柱純化各重組蛋白，SDSPAGE 鑒定各表達(dá)產(chǎn)物及其純化效果。以鼠抗His MAb（1：1 000）為一抗，以兔抗鼠IgG-HRP（1：4 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定各純化重組蛋白的反應(yīng)原性。鑒定正確的各重組蛋白分別命名為rLT2、mrLT2-R5K、 mrLT2-H42A、 mrLT2-S59K、 mrLT2-V95K、mrLT2-Y102K、mrLT2-E110K。

1.4 各重組蛋白對(duì)Y1 細(xì)胞的毒性作用和對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn) 大量表達(dá)并純化各重組蛋白，利用BCA 試劑盒測定各重組蛋白的濃度。參照文獻(xiàn)[11]，將各重組蛋白調(diào)整為1 mg/mL 后10 倍倍比稀釋（1 mg/mL～1×10-5mg/mL），加入長滿Y1 細(xì)胞單層的96 孔板，100 μL/孔，每個(gè)稀釋度做8 個(gè)重復(fù)孔，以細(xì)胞維持液作為陰性對(duì)照，在37 ℃作用2 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，棄上清，每孔加入100 μL 細(xì)胞維持液，持續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄結(jié)果。按照Reed-Muench 法計(jì)算各重組蛋白對(duì)Y1 細(xì)胞的半數(shù)致死量（TCID50），分析各重組蛋白對(duì)Y1 細(xì)胞的毒性作用。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，取42 只4 周齡BALB/c 小鼠隨機(jī)分為7 組（A 組～G 組），每組6 只，雌雄各半，小鼠禁食24 h。參照重組蛋白對(duì)Y1 細(xì)胞的TCID50試驗(yàn)結(jié)果， 將rLT2、 mrLT2-V95K 分別10 倍倍比稀釋（4 mg/mL～4×10-2mg/mL），A、B、C 組小鼠分別灌胃上述濃度的rLT2，D、E、F 組小鼠分別灌胃上述濃度的mrLT2-V95K，G 組小鼠作為對(duì)照組灌胃滅菌PBS。灌胃前30 min 每只小鼠灌服1% NaHCO3以中和胃酸，100 μL/只。灌胃后連續(xù)觀察并記錄7 d 內(nèi)小鼠的臨床癥狀。如有死亡，計(jì)算相應(yīng)重組蛋白對(duì)小鼠的TCID50。

1.5 各重組蛋白對(duì)小鼠的免疫原性檢測 參照文獻(xiàn)[12]，將9 只4 周齡BALB/c 小鼠隨機(jī)分為3 組，每組3只，分別接種用等量完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑乳化的rLT21（1 mg/mL）、mrLT2-V95K（1 mg/mL）和滅菌PBS 溶液，200 μL/只，間隔1 周共免疫3 次。首次接種用完全弗氏佐劑乳化的抗原，第二、三次接種用不完全弗氏佐劑乳化的抗原。分別于首免后第0、7 d、14 d，尾靜脈采血，第21 d 麻醉后摘眼球采血，分離血清。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以rLT2 為包被抗原，0.2 μg/孔，以待檢血清作為一抗，用PBST 以1：100 稀釋后作為起始濃度，在酶標(biāo)板上2 倍倍比稀釋（1：100～1：102 400），每個(gè)稀釋梯度設(shè)置3 個(gè)平行孔，以羊抗鼠IgG-HRP（1：4 000）為二抗，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA 方法檢測各組小鼠的血清特異性抗體。

取首免后21 d 采集的各組小鼠血清檢測其針對(duì)rLT2 的中和抗體。將各組免疫小鼠血清56 ℃水浴30 min；取100 TCID50rLT2 分別與3 組小鼠血清的2倍倍比稀釋液（20～2-5）在96 孔板中等量混合后于37 ℃、5% CO2作用1 h，將混合液加入長滿單層Y1細(xì)胞的96 孔板各孔中作用2 h，棄上清，每孔加入200 μL 維持液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)，以Reed-Muench 法計(jì)算小鼠血清的中和抗體效價(jià)。設(shè)只加入細(xì)胞維持液的細(xì)胞為陰性對(duì)照，以加入rLT2的細(xì)胞為陽性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1elt2各突變基因的PCR 擴(kuò)增及各重組菌的構(gòu)建與鑒定 以提取的E. coliDN1502 株DNA 為模板，以LT2-F/LT2-R 為引物PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測和序列測定，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 111 bp，其中目的基因與elt2參考序列（1 077 bp）一致。以PCR 擴(kuò)增的各突變基因前后兩片段為模板，采用SOE PCR 分別擴(kuò)增了LT2A 6 個(gè)不同氨基酸位點(diǎn)（R5K、H42A、S59K、V95K、Y102K、E110K）的突變基因，測序結(jié)果顯示6 個(gè)突變基因大小均為1 111 bp，除突變位點(diǎn)外，其余序列與elt2序列一致。分別將elt2和各突變基因克隆至pET-30a 中構(gòu)建各重組質(zhì)粒，各重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切得到約1 000 bp 和5 000 bp 兩個(gè)片段（圖1A、圖1B），雙酶切和測序結(jié)果表明各重組質(zhì)粒均正確構(gòu)建，空載體雙酶切作為對(duì)照（圖1C）；將其轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細(xì)胞，獲得了各重組大腸桿菌pET-30a-elt2/BL21、pET-30a-E110K/BL21、 pET-30a-Y102K/BL21、 pET-30a-V95K/BL21、pET-30a-R5K/BL21、pET-30a-S59K/BL21、pET-30a-H42A/BL21。

圖1 各突變基因重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of recombinant plasmids of each mutant gene

2.2 各重組蛋白的表達(dá) 以優(yōu)化條件培養(yǎng)、誘導(dǎo)各重組菌表達(dá)目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 分析顯示，與pET-30a/BL21 表達(dá)產(chǎn)物比較，各重組菌表達(dá)產(chǎn)物分別在32 ku～42 ku 和10 ku～17 ku 處均有明顯的目的蛋白條帶，分別為LT2A 和LT2B，經(jīng)HisTrap 層析柱純化后的蛋白條帶清晰，純化效果較好，與預(yù)期大?。?9 ku、13 ku）一致（圖2）。

圖2 各重組蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE鑒定結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

Western blot 結(jié)果顯示，各重組蛋白均能夠與His MAb 反應(yīng)（圖3），表明獲得了各重組蛋白rLT2、mrLT2-E110K、mrLT2-Y102K、mrLT2-V95K、mrLT2-R5K、mrLT2-S59K、mrLT2-H42A，且各重組蛋白的反應(yīng)原性較強(qiáng)。

圖3 重組蛋白的western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Western blot analysis of recombinant proteins

2.3 各重組蛋白的毒性作用檢測 各重組蛋白對(duì)Y-1 細(xì)胞的毒性試驗(yàn)觀察的結(jié)果顯示，接種毒素蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生不同程度病變，表現(xiàn)為由Y 型逐漸圓縮，細(xì)胞間隙變大，甚至死亡。部分突變蛋白毒性相近，作用于細(xì)胞后細(xì)胞狀態(tài)基本一致，因此選取代表性圖片作為結(jié)果。經(jīng)計(jì)算測得其他各組重組蛋白對(duì)Y-1 細(xì)胞的毒性作用，rLT2 為1.477×105TCID50/0.1 mL、mrLT2-R5K 為3.51×102TCID50/0.1 mL、mrLT2-H42A 為1.303×102TCID50/0.1 mL、 mrLT2-S59K 為3.542×102TCID50/0.1 mL、 mrLT2-V95K 為1.145×101TCID50/0.1 mL、mrLT2-Y102K 為5.249×103TCID50/0.1 mL、mrLT2-E110K 為1.069×102TCID50/0.1 mL。各突變重組蛋白的毒性作用相較于rLT2 均有明顯減弱（圖4），其中mrLT2-V95K 的毒性最弱。用重組蛋白rLT2 和mrLT2-V95K 給小鼠灌胃后，在7 d 觀察期內(nèi)各組小鼠均飲食正常，無異常臨床表現(xiàn)，且均健活，無死亡，表明LT2 毒素對(duì)小鼠無明顯毒性作用，且小鼠不是監(jiān)測LT2 的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

圖4 各重組蛋白對(duì)Y1細(xì)胞的毒性作用Fig.4 Toxic effects of recombinant proteins on Y1 cells

2.4 各重組蛋白對(duì)小鼠的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果 分別用rLT2 和mrLT2-V95K 為抗原免疫小鼠后，采用間接ELISA 方法定期檢測小鼠血清中針對(duì)rLT2 的特異性IgG 水平，結(jié)果顯示，首次免疫后7 d、14 d、21 d，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的rLT2 抗體水平均顯著高于PBS 組小鼠血清（P＜0.05），隨著時(shí)間變化和加強(qiáng)免疫，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗體水平不斷升高，第21 d 的抗體水平最高。其中mrLT2-V95K 組的抗體水平始終高于rLT2 組（P＜0.05）（圖5），表明該突變并未對(duì)重組菌株的免疫原性產(chǎn)生影響。

圖5 免疫小鼠血清中特異性IgG抗體水平的檢測結(jié)果Fig.5 Serum specific IgG levels in immunized mice

采集首免后21 d 各組小鼠的血清，以固定毒素稀釋血清的方法檢測血清中針對(duì)rLT2 的中和抗體效價(jià)，結(jié)果顯示PBS 組小鼠血清中和抗體效價(jià)為0，rLT2 組中和抗體效價(jià)為1：11.9，mrLT2-V95K 組中和抗體效價(jià)為1：32。表明rLT2 和mrLT2-V95K 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體均具有中和rLT2 的活性，二者無明顯差異。

3 討 論

ETEC 產(chǎn)生的LT1 和LT2 均是由1 個(gè)A 亞基和5 個(gè)B 亞基組成的AB5型六聚體蛋白，序列分析顯示LT1A 與LT2A 氨基酸相似性為50.4%～54.6%[13]，因此以往對(duì)LT1A 突變體毒性的研究為本研究快速篩選LT2A 毒性關(guān)鍵氨基酸和位點(diǎn)提供了線索，因此對(duì)LT2A 6 個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別突變，即R5K、H42A、S59K、V95K、Y102K、E110K。重組蛋白對(duì)Y-1 細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，LT2A 第95 位纈氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔╩rLT2-V95K）后，其毒性較rLT2 顯著降低，用其免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)略高于rLT2 組，與其抗體對(duì)rLT2 中和活性略高于rLT2 組抗體是一致的，這可能是由于抗原毒性的降低有助于更好地誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)。本研究的V95K 只是單一突變，如果聯(lián)合突變其他位點(diǎn)氨基酸是否會(huì)更顯著地降低LT2的毒性以及突變減毒的機(jī)制，需進(jìn)一步深入研究。

Y-1 細(xì)胞作為檢測LT2 毒性的模式細(xì)胞在針對(duì)LT2 的研究中應(yīng)用廣泛[14]，但除犢牛外檢測LT2 的模式動(dòng)物至今尚不明確。Holmes 和Casey 等證實(shí)LT2a和LT2b 均不會(huì)引起兔或豬腸袢中的液體分泌，而LT2a 和LT2b 均可以引起犢牛腸袢的液體分泌[15-16]。本研究所用親本菌株E. coliDN1502 分泌的腸毒素類型為LT2c，與LT2a、LT2b 同屬LT2 型不耐熱腸毒素，且與LT2 具有相似的生物學(xué)特性，因此未選擇兔或豬而選擇小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。用rLT2 和mrLT2-V95K 給BALB/c 小鼠灌胃，在觀察期內(nèi)小鼠均健活，無腹瀉和死亡現(xiàn)象，表明BALB/c 小鼠也不是檢測LT2 的理想模式動(dòng)物。由于以犢牛為模式動(dòng)物開展對(duì)LT2 的研究費(fèi)用較高，因此制約了LT2 致病性以及致病機(jī)制的研究。為深化LT2 的研究，模式動(dòng)物的發(fā)現(xiàn)和篩選應(yīng)當(dāng)受到該領(lǐng)域研究者的關(guān)注。

LT1 和LT2 均為AB5 型低聚蛋白，LT2A 具有較強(qiáng)的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，是毒素毒力活性中心；LT2B 本身無毒性作用，具有良好的免疫原性和黏膜佐劑效應(yīng)，通過與細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)傳遞A 亞基，并由A 亞基發(fā)揮毒性作用，使多數(shù)哺乳動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞中的cAMP 升高并導(dǎo)致大量分泌的電解質(zhì)和水進(jìn)入腸腔，臨床表現(xiàn)為人類和動(dòng)物的腹瀉[17-18]。本研究的V95K 突變位于LT2A，減弱了LT2 的毒性，但未改變B 亞基及其與神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合能力，因此該突變對(duì)mrLT2-V95K的免疫原性無顯著影響。本研究篩選證明LT2A V95K 突變可顯著降低LT2 的毒性，這不僅為LT2 毒性分子機(jī)制的研究提供了科學(xué)信息，也為構(gòu)建大腸桿菌減毒突變菌株和大腸桿菌減毒口服疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。