包媛玲，宋守生，于蒙蒙，劉 鵬，任殿新，孟令宅，王素艷，李欣翼，張 卓，劉愛晶，張艷萍，劉長軍，祁小樂，王笑梅，高玉龍,3*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/禽免疫抑制病創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2.內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 敖漢旗 024300；3.國家禽類實驗動物資源庫，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽偏肺病毒（avian metapneumovirus，aMPV）屬于副粘病毒科，肺炎病毒亞科，偏肺病毒屬[1]。aMPV為單股不分節(jié)段的負鏈RNA 病毒，分為A、B、C、D 4 個亞型[2-3]。

aMPV 的自然宿主為雞和火雞，不同品系的雞均能感染aMPV，且各種日齡均易感[4-5]。aMPV 感染火雞引起鼻氣管炎，感染雞引起腫頭綜合征。感染蛋雞能夠造成嚴重的產(chǎn)蛋下降[6]。2000 年，Cook 等用B亞型aMPV（aMPV/B）分離株靜脈注射蛋雞，蛋雞感染后出現(xiàn)精神沉郁、嚴重的產(chǎn)蛋率下降和軟殼率升高等臨床癥狀，進一步證實aMPV/B 對蛋雞具有顯著的致病性[7]。該病傳染性強、發(fā)病率可高達100%[8]。若出現(xiàn)混合感染，該病的死亡率可達25%～40%。

自1978 年aMPV 首次在南非發(fā)現(xiàn)以來，該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛流行，在除大洋洲以外的家禽飼養(yǎng)區(qū)域均有分布[9-10]。流行病學調(diào)查結果顯示，我國的種雞群中普遍存在aMPV 感染，包括A、B 和C 3種亞型，有的種雞群血清陽性率高達100%[11-12]。面對aMPV 的廣泛流行，疫苗免疫可有效預防aMPV的感染，降低患病率，減少經(jīng)濟損失。目前針對C亞型aMPV 的疫苗主要在美國用于預防火雞感染aMPV/C；針對A 和B 亞型aMPV 的活疫苗和滅活疫苗在全世界范圍內(nèi)已被廣泛應用，對該病的防控起到重要作用。然而，我國目前還沒有批準用于預防aMPV 的相關疫苗。

本實驗室前期以從我國雞群分離的aMPV/B LN16 株為種毒[13]，研制B 亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗[14]。本研究將該滅活疫苗免疫3 周齡的商品蛋雞并進行了系統(tǒng)的免疫保護效果評價，為商品蛋雞B 亞型禽偏肺病毒病的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒株及實驗動物 Vero 細胞由本實驗室保存；aMPV/B LN16 強毒株及滅活疫苗用病毒株由本實驗室分離、鑒定并保存[13-14]，病毒效價高于105.5TCID50/mL；1 日齡蛋雞購自哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑 反轉錄試劑盒HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR 購自南京諾唯贊有限公司；aMPV 抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX 公司。

1.3 實驗設計 選取3 周齡商品蛋雞，隨機分成兩組：免疫組（n=13）和對照組（n=13）。免疫組采取胸肌注射方式接種0.5 mL 滅活疫苗，對照組胸肌注射0.5 mL 的無菌PBS。初次免疫后3 周加強免疫一次。初次免疫后1 周～6 周采集非抗凝血，于37 ℃放置30 min，后置于4 ℃4 h，1 000 r/min 離心5 min 分離血清。蛋雞隔離飼養(yǎng)于負壓隔離器內(nèi)，加強免疫后3周攻毒（aMPV/B LN16 強毒滴鼻200 μL，5 000 TCID50/只），觀察攻毒后1 d～8 d的臨床癥狀，每天上午和下午各觀察一次，攻毒后1 d～8 d 每天采集鼻腔拭子。攻毒后9 d 每組隨機抽取3 只蛋雞迫殺后剖檢，取蛋雞的鼻甲、氣管和肺臟樣品固定于10%福爾馬林中，用于病理切片的觀察。

1.4 各組雞血清抗體水平的ELISA檢測 將分離的血清按照aMPV 抗體ELISA 檢測試劑盒說明書經(jīng)1：500稀釋后，檢測其中的aMPV 抗體水平。

1.5 各組雞血清中和抗體效價的測定 采用病毒中和試驗檢測初次免疫后1 周～6 周的雞血清中和抗體效價。將Vero 細胞在96 孔板中于37 ℃5% CO2培養(yǎng)。將血清于56 ℃滅活30 min，用0.45 μm 濾器過濾后2倍倍比稀釋。將稀釋后的血清與aMPV LN16 強毒（4 000 TCID50/mL）等體積混合，于37 ℃孵育1 h 后取100 μL 加入6 個重復孔中孵育1 h。用無血清DMEM 清洗細胞，加入孵育后的樣品，每個樣品做6 個重復，置37 ℃孵育1 h，換為含1%牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細胞病變效應（CPE），連續(xù)記錄7 d。中和抗體效價表示為使細胞病變數(shù)量減少50%的最高血清稀釋濃度的反比，利用Reed-Muench 方法計算中和效價。

1.6 各組雞排毒檢測 根據(jù)LN16 株核苷酸序列（MH745147）和參考文獻設計引物及探針，引物序列為：5'-AATAGTCCTCAAGCAAGTCCTCAGA-3'/5'-CT GTTGTAATTTGACCTGTTCTACACT-3'，探針為5'-F AM-CTGGTGTTATCAGCCTTAGGCTTGACGCT-TAMR A-3'[15]。將采集的鼻腔拭子，溶于600 μL PBS 中，渦旋振蕩混勻后300 r/min 離心5 min，取200 μL 上清提取樣品的全基因組RNA，反轉錄為cDNA 后作為模板。采用文獻[15]的熒光定量PCR 方法檢測aMPV/B，根據(jù)標準質粒拷貝數(shù)，計算樣品中病毒拷貝數(shù)。

1.7 各組雞組織病理學觀察 取固定于10%福爾馬林中的商品蛋雞的鼻甲、氣管和肺臟，按常規(guī)包埋，制作病理切片，HE 染色后鏡檢。

2 結 果

2.1 各組雞血清抗體水平的ELISA 檢測結果 采用aMPV 抗體ELISA 檢測試劑盒檢測商品蛋雞初次免疫后1 周～6 周的血清抗體水平。結果顯示免疫組商品蛋雞的血清抗體水平逐漸升高，免疫后2 周其血清抗體陽性率為100%，初次免疫后3 周平均抗體效價為39 948，加強免疫后3 周該組蛋雞平均抗體效價為73 522，加強免疫后2 周～3 周，抗體水平較單次免疫后3 周顯著升高（P＜0.0001）。而陰性對照組血清抗體呈陰性（圖1）。上述結果表明，該滅活疫苗能夠誘導商品蛋雞產(chǎn)生高水平的aMPV 特異性抗體。

圖1 B亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗免疫后商品蛋雞血清中的抗體水平Fig.1 Serum antibody levels of commercial layerhens immunized with avian metapneumovirus disease(subtype B)inactivated vaccine

2.2 各組雞中和抗體水平檢測結果 攻毒后1 周～6周每周采集血清，采用固定病毒稀釋血清的方式檢測免疫組商品蛋雞免疫滅活疫苗后不同時間的中和抗體水平。結果顯示，免疫后2 周其中和抗體轉陽，免疫后3 周中和抗體陽性率為100.0%。在初次和加強免疫后3 周，中和抗體幾何平均值分別為5.6 log2和7.6 log2（表1）。上述結果表明，該滅活疫苗能夠誘導商品蛋雞產(chǎn)生高水平的中和抗體。

表1 B亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗免疫后商品蛋雞的血清中和抗體水平Table 1 Serum neutralizing antibody levels of commercial layerchickens immunized with avian metapneumovirus disease(subtype B)inactivated vaccine

2.3 各組雞臨床癥狀觀察結果 加強免疫3 周后攻毒并觀察攻毒后1 d～8 d 各組雞的臨床癥狀，結果顯示，攻毒對照組雞在攻毒后3 d 開始出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)混濁或粘稠泡沫樣鼻液、個別雞有鼻痂等，觀察至攻毒后7 d，臨床癥狀完全消失，攻毒對照組發(fā)病率為92.3%（12/13）。在整個實驗過程中免疫組商品蛋雞未出現(xiàn)上述癥狀，各組雞精神狀態(tài)、采食及飲水均未見明顯異常。上述結果表明，該滅活疫苗能夠有效保護商品蛋雞免受aMPV/B 強毒的攻擊。

2.4 各組雞排毒檢測結果 攻毒后1 d～8 d，采集各組蛋雞鼻腔拭子，采用RT-qPCR方法檢測鼻腔拭子中的病毒拷貝數(shù)。結果顯示，攻毒后1 d～5 d，免疫組雞鼻腔拭子中的平均病毒拷貝數(shù)分別為962、2 211、16 323、5 538、1 585；對照組雞鼻腔拭子中的平均病毒拷貝數(shù)為10 702、44 079、61 314、47 153、23 192。免疫組雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數(shù)較攻毒對照組分別下降91.0%、95.0%、73.7%、88.2%、93.2%。攻毒后6 d，未在各組商品蛋雞的鼻腔拭子中檢測到病毒（圖2）。上述結果表明，該滅活疫苗能夠顯著降低病毒在商品蛋雞呼吸道中的復制水平。

圖2 aMPV/B強毒攻毒后商品蛋雞排毒情況Fig.2 Virusshedding of commercial layerhensin the immunization group and control group after virulent aMPV/B challenge

2.5 各組雞組織病理學觀察結果 攻毒后9 d 各組分別取3 只雞迫殺，取鼻甲、氣管和肺臟固定并進行HE 染色，觀察組織病理變化。結果顯示：攻毒對照組雞鼻甲的鼻黏膜固有層和黏膜下層內(nèi)有炎性細胞浸潤（圖3D）；氣管黏膜固有層內(nèi)有少量的炎性細胞和異嗜細胞浸潤（圖3E）；肺臟局部淋巴組織有炎性細胞和異嗜細胞浸潤（圖3F）；免疫組商品蛋雞鼻甲（圖3A）、氣管（圖3B）及肺臟（圖3C）均未見明顯病理變化。上述結果表明，B 亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗能夠有效防止商品蛋雞呼吸器官在強毒攻擊后出現(xiàn)炎癥反應。

圖3 aMPV/B強毒攻毒后商品蛋雞的病理組織切片觀察（圖示標尺為100μm）Fig.3 Pathological section of the turbinate,trachea and lung of commercial layerhens after virulent aMPV/B challenge（Scale bars for H&E indicate 100μm）

3 討 論

aMPV 是雞和火雞急性呼吸道疾病的病原體，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，造成了巨大的經(jīng)濟損失。研究表明，我國種雞群中普遍感染aMPV，該病毒對肉雞和蛋雞均具有較強的致病性，嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[16-18]。為控制其在我國的傳播和流行，本實驗室前期研制了B 亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗，并證實其對SPF 雞具有良好的免疫保護效果。為滿足生產(chǎn)實際的需要，本研究系統(tǒng)評估了該滅活疫苗對商品蛋雞的免疫保護效果，為蛋雞養(yǎng)殖場aMPV 疫苗的選擇及免疫程序的制定提供參考。

研究表明，油乳劑疫苗能夠在注射部位招募和激活細胞，抗原遞呈細胞攝取抗原并將其運輸?shù)搅馨徒Y，激活產(chǎn)生抗原特異性抗體的B 細胞并促進其分化為記憶B 細胞[19]。激活機體特異性體液免疫反應是滅活疫苗發(fā)揮作用的關鍵過程，因此本研究檢測了該滅活疫苗免疫后商品蛋雞血清中的抗體水平。本研究采用的免疫程序為3 周齡初次免疫，6 周齡加強免疫。血清ELISA 抗體檢測及中和試驗結果顯示，加強免疫后3 周，免疫組雞平均抗體水平可達73 522，平均中和抗體效價為7.6log2，表明該滅活疫苗能夠誘導蛋雞產(chǎn)生良好的體液免疫反應。已有研究表明，中和抗體是保護性免疫反應的關鍵因子，它們可以與病毒顆粒結合從而阻止病毒進入宿主細胞[20]。與未免疫組相比，免疫雞鼻腔拭子中的病毒拷貝數(shù)顯著降低，說明該滅活疫苗刺激機體產(chǎn)生的免疫反應能抑制aMPV 的復制，從而降低病毒的排出和擴散。加強免疫后3 周用aMPV/B 強毒攻毒，免疫組商品蛋雞未出現(xiàn)aMPV 相關臨床癥狀，而攻毒組商品蛋雞發(fā)病率為92.3%。上述結果表明，根據(jù)本研究設定的免疫程序，該滅活疫苗能夠有效保護商品蛋雞免受aMPV/B 強毒的攻擊。

aMPV 所引發(fā)的臨床癥狀在很大程度上受到繼發(fā)性細菌感染的影響。在單一感染時，該病的死亡率較低，但若出現(xiàn)繼發(fā)性細菌感染，死亡率可高達25%～40%。呼吸道黏膜是機體防御體系的重要組成部分，當黏膜損傷時，容易繼發(fā)感染其他病原菌。aMPV/B 強毒攻擊后，攻毒對照組蛋雞的呼吸道出現(xiàn)不同程度的病理損傷，主要表現(xiàn)為炎癥細胞的增多和腺上皮細胞的脫落，而免疫組商品蛋雞的呼吸道未見明顯的病理變化。這表明該滅活疫苗能夠保護商品蛋雞呼吸道黏膜的完整性，確保其機體的第一道防線不被破壞，從而降低了其他病原體侵入的風險。

疫苗接種是防控aMPV 傳播與流行的重要手段。本研究表明B 亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗對商品蛋雞具有良好的免疫保護效果，為蛋雞養(yǎng)殖場中B 亞型禽偏肺病毒病的防控提供了參考，為控制國內(nèi)aMPV 的流行提供了重要參考。