于水發(fā)，馬忠臣，徐藝玫，苗玉和，胡瑞瑞，王 震，易繼海，李志強，王 勇*，陳創(chuàng)夫*

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，新疆 石河子 832003；3.新疆疾病預(yù)防控制中心，新疆 烏魯木齊 830002；4.福建圣維生物科技有限公司，福建 南平 354100；5.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；6.商丘師范學(xué)院，河南 商丘 476000）

布魯氏菌病是人畜共患病，曾被稱為馬耳他熱、地中海熱、波動熱、邦氏病，遍布于世界各地[1]。目前為止，布魯氏菌屬多達十幾個種，其中羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌（B. suis）和犬種布魯氏菌（B. canis）可感染人誘發(fā)布魯氏菌病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等全身衰弱性疾病[2]。

布魯氏菌經(jīng)過粘附侵襲、隱蔽、增殖和釋放等過程在宿主內(nèi)建立循環(huán)感染體系[3]。其感染最顯著的特點是以“隱蔽策略”逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，最終建立慢性和長期感染[4]。布魯氏菌的分泌蛋白即效應(yīng)蛋白BAB1_0678（BspA）、 BAB1_0712（BspB）、BAB1_0847（BspC）和BAB1_1948（BspF）已被陸續(xù)報道[5]，其對布魯氏菌胞內(nèi)的生存非常重要。有研究表明，在布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞的階段分泌BspG（BAB1_0227），在進入宿主細(xì)胞核時發(fā)揮特定的功能[6]。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，BspG 定位于宿主細(xì)胞核，可能具有核-胞穿梭機制。原核表達的BspG具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，但其在病原菌胞內(nèi)存活中的作用尚未見報道[7-8]。BspG基因所編碼的蛋白質(zhì)是新發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌的一個分泌蛋白，其被布魯菌分泌后，主要分布在宿主細(xì)胞核及核周圍，但其功能目前尚不清楚，為探究BspG基因在布魯氏菌致病機理及胞內(nèi)生存中的潛在功能，本研究通過構(gòu)建B. abortus BspG基因缺失株（ΔBspG）及回補株（pBspG），并利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 鑒定了BspG基因?qū)α鳟a(chǎn)布魯氏菌（B. abortus）感染及胞內(nèi)定植能力的影響，為布魯氏菌BspG的功能研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料Brucella abortus2308 株由中國疾病預(yù)防控制中心提供；大腸桿菌DH5α 標(biāo)準(zhǔn)株由西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心提供；pMD19-T 載體購自TaKaRa 公司；pBBR1MCS-4載體購自Miaolingbio 公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；布魯氏菌液體培養(yǎng)基（BBLTMBrucellaBroth）及布魯氏菌固體培養(yǎng)基（BBLTMBrucellaAgar）購自美國BD 公司；DMEM 培養(yǎng)液購自美國Thermo 公司；胎牛血清購自Gibco 公司。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 中布魯氏菌基因組序列（DK63_1762），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計BspG基因上游同源臂（447 bp）、下游同源臂基因（514 bp）的擴增引物、BspG基因擴增引物及卡那（Kan）抗性基因擴增引物（下劃線部分），引物序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 重組質(zhì)粒pMD19-BspG-Kan、pBBR1MCS-4-BspG的構(gòu)建與鑒定 以提取的B. abortusDNA 為模板，以BspG-U-F/BspG-U-R 為引物，PCR 擴增BspG基因上游同源臂；以BspG-D-F/BspG-D-R 為引物，PCR 擴增BspG基因的下游同源臂；以BspG-UR/BspG-D-F 引物PCR 擴增Kan抗性基因。以上述擴增的基因片段經(jīng)融合PCR 擴增， PCR 產(chǎn)物純化回收后由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司測序后克隆至pMD19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-BspG-Kan；以提取的B. abortusDNA 為模板，BspG-F/BspG-R 為引物PCR 擴增BspG基因，克隆至pBBR1MCS-4 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBR1MCS-4-BspG。構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR 及測序鑒定。

1.4B. abortus BspG基因缺失株和回補株的構(gòu)建與鑒定 將500 ng 重組質(zhì)粒pMD19-BspG-Kan電轉(zhuǎn)化至B. abortus2308 感受態(tài)細(xì)胞中， 37 ℃180 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h 后涂布含Kan抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h～96 h，挑單菌落，利用BspG-F/BspG-R 和BspG-U-F/BspG-D-R 引物分別經(jīng)PCR 鑒定，并由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司測序鑒定，獲得布魯氏菌BspG缺失株（ΔBspG）。將重組質(zhì)粒pBBR1MCS-4-BspG電轉(zhuǎn)化至ΔBspG中，經(jīng)Kan+、AMP+抗性平板培養(yǎng)后挑取單克隆菌落，采用BspG-F/BspG-R 引物經(jīng)PCR鑒定后獲得BspG基因回補株（pBspG）。上述PCR 鑒定均設(shè)B.abortus2308株為對照。

1.5B. abortus BspG基因缺失株和回補株的遺傳穩(wěn)定性分析 將初步篩選獲得的ΔBspG、pBspG連續(xù)傳15 代，每隔5 代提取細(xì)菌DNA，分別以BspG-F/BspG-R 和BspG-U-F/BspG-D-R 為引物對ΔBspG和pBspG經(jīng)PCR 鑒定，分析各菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.6 各菌株生長曲線的測定 將親本株、ΔBspG和pBspG分別于37 ℃170 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔2 h分別取樣，測OD600nm值，直至細(xì)菌進入平臺期（大概28 h），以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制上述3 株菌的生長曲線，分析各菌株的生長特性。

1.7 各菌株對RAW 264.7 細(xì)胞粘附與侵襲力影響的檢測 待六孔板中培養(yǎng)的RAW 264.7 細(xì)胞達到每孔約2×106個時，按照MOI 100 將ΔBspG、pBspG和親本株分別感染RAW 264.7，分別于感染15 min、30 min、45 min、60 min 后，加入慶大霉素（50 μg/mL）殺死未粘附的細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，加入0.3% 溶酶素裂解細(xì)胞釋放出細(xì)菌，將裂解液按照101～105稀釋后分別涂布于布魯氏菌固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d 后進行菌落計數(shù)。以親本株作為參考，分析ΔBspG和pBspG對RAW 264.7 細(xì)胞的粘附與侵襲力。

1.8 各菌株在RAW 264.7 細(xì)胞中的生存能力試驗將RAW 264.7 細(xì)胞于六孔板中培養(yǎng)，每孔數(shù)量為2×106個，按照MOI 100 將ΔBspG、pBspG和親本株分別分別感染RAW 264.7 細(xì)胞，1 h 后，加入慶大霉素（50 μg/mL）殺死胞外細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 后，加入0.3% 溶酶素裂解細(xì)胞，按照101～105稀釋后分別涂布于布魯氏菌固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d 后計算菌落數(shù)量，分析各菌株在RAW 264.7 細(xì)胞中的生存能力。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 每組實驗均重復(fù)3 次，所有的結(jié)果均以±s表示，使用SPSS Statistics 23 分析數(shù)據(jù)的相關(guān)性與差異性，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 以B.abortusDNA為模板，分別經(jīng)PCR 擴增BspG基因的上游、下游同源臂基因及Kan抗性基因片段，并經(jīng)融合PCR 擴增后克隆至pMD19-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-BspG-Kan并經(jīng)PCR 及測序鑒定。結(jié)果顯示，所測序列確為上述3 種基因的融合基因片段。將BspG基因克隆至pBBR1MCS-4 載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBR1MCS-4-BspG 并經(jīng)PCR 和測序鑒定。結(jié)果顯示，PCR 及測序結(jié)果均正確。上述結(jié)果表明，正確構(gòu)建了上述兩個重組質(zhì)粒。

2.2B. abortus BspG基因缺失株的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pMD19-BspG-Kan電轉(zhuǎn)化B. abortus后涂布Kan+布魯氏菌培養(yǎng)板，挑單菌落經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，采用BspG-U-F/BspG-D-R 引物經(jīng)PCR 擴增出2 095 bp 的融合基因片段，而B. abortus無該條帶（圖1A）；采用BspG-F/BspG-R 引物經(jīng)PCR 未擴增出651 bp 的BspG基因，而親本株B. abortus擴增出了BspG基因（圖1B），經(jīng)測序后表明正確構(gòu)建了BspG基因缺失株ΔBspG。

圖1 缺失株ΔBspG的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of deletion strain ΔBspG

2.3B. abortus BspG基因回補株的構(gòu)建 將pBBR1MCS-4-BspG電轉(zhuǎn)化至ΔBspG感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性篩選ΔBspG基因回補株，并以BspG-F/BspG-R 引物經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，獲得大小為651 bp 的目的片段，與親本株B. abortus2308 擴增的目的條帶基本一致（圖2），PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序后與預(yù)期BspG基因序列一致，表明正確構(gòu)建基因回補株pBspG。

圖2 回補株pBspG的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results of the complemented strain pBspG

2.4B. abortus BspG基因缺失株和回補株的遺傳穩(wěn)定性檢測 將ΔBspG，和pBspG傳15 代，每隔5 代均利用BspG-F/BspG-R 對上述菌株經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，5 代、10 代、15 代的ΔBspG菌株均未擴增出651 bp 的目的條帶（圖3A）；而5 代、10 代、15 代的pBspG菌株則均擴增出651 bp 的目的條帶（圖3B），均與預(yù)期結(jié)果相符，可見在經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)15 代后ΔBspG均未出現(xiàn)回復(fù)突變，pBspG則均未出現(xiàn)基因丟失。表明構(gòu)建的ΔBspG和pBspG遺傳穩(wěn)定性均較強。

圖3 缺失株ΔBspG（A）和回補株pBspG（B）的遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果Fig.3 Analysis of genetic stability of the deletion strain ΔBspG(A)and the complemented strain pBspG(B)

2.5 各菌株生長曲線的測定 將親本株、ΔBspG和pBspG培養(yǎng)后，檢測各時間點OD600nm值，繪制生長曲線。結(jié)果顯示，ΔBspG、pBspG均與親本株生長趨勢相似，培養(yǎng)4 h時進入對數(shù)生長期，32 h進入平臺期，但在同一時間點ΔBspG和pBspG的OD600nm值均極顯著或者顯著低于親本株（圖4）（P＜0.05）。表明BspG基因的缺失顯著抑制布魯氏菌的體外生長能力。

圖4 各菌株生長曲線的測定結(jié)果Fig.4 Results of the growth curve of each strain

2.6 各菌株對RAW 264.7 細(xì)胞的粘附與侵襲力試驗結(jié)果 將ΔBspG、pBspG及親本株分別感染RAW264.7細(xì)胞后不同時間檢測細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果顯示，在感染后15 min～60 min，RAW 264.7 細(xì)胞中的活菌數(shù)量均緩慢增長，但感染后不同時間，ΔBspG和pBspG的活菌數(shù)量均與親本株無顯著差異（P＞0.05）（圖5）。表明BspG基因的缺失對布魯氏菌在RAW 264.7 細(xì)胞中的粘附與侵襲能力均無影響。

圖5 各菌株對RAW 264.7細(xì)胞黏附及侵襲試驗結(jié)果Fig.5 Results of adhesion and invasion tests of each strain on RAW 264.7 cells

2.7 各菌株在RAW 264.7 細(xì)胞中生存能力的試驗結(jié)果 將ΔBspG、pBspG和親本株分別感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 后，于不同時間段檢測細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌的活菌數(shù)量。結(jié)果顯示，在感染后4 h～24 h，各菌株在RAW 264.7 細(xì)胞內(nèi)均緩慢增長，且ΔBspG的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量與親本株差異均不顯著（P＞0.05）；而24 h 后各組細(xì)菌數(shù)量均急劇增長，且ΔBspG的胞內(nèi)活菌數(shù)量均極顯著低于親本株（P＜0.01）。而pBspG 的胞內(nèi)活菌數(shù)量在上述時間段均與親本株無顯著差異，pBspG恢復(fù)了BspG缺失造成的復(fù)制缺陷（圖6）。表明布魯氏菌BspG缺失可降低其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。

圖6 各菌株在RAW 264.7細(xì)胞中生存能力的試驗結(jié)果Fig.6 Results of experiments on the viability of each strain in RAW 264.7 cells

3 討 論

布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，其致病的關(guān)鍵取決于其感染吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的能力[9]。在其侵襲宿主細(xì)胞過程中，布魯氏菌與宿主內(nèi)體相互作用并獲得若干標(biāo)記，包括Rab5、早期內(nèi)體抗原（EEA-1）和Rab7 等，從而形成“布魯氏菌小體”（Brucella-containing vacuoles，BCV）。BCV 與溶酶體的融合、其內(nèi)容物的降解及內(nèi)化布魯氏菌的殺滅均可能涉及BCV的酸化過程并觸發(fā)VirB 操縱子激活Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）[10]，從而將多種分泌蛋白包括BspG 釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，布魯氏菌隨后遷移并到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）中。在ER 中，布魯氏菌建立其復(fù)制BCV（rBCV），并大量增殖。迄今為止，只鑒定出了少數(shù)布魯氏菌的分泌蛋白[11]。BspG 是分泌蛋白，但其分泌轉(zhuǎn)運途徑尚不明確。本研究構(gòu)建了BspG基因缺失株和回補株，并繪制了缺失株、回補株和親本株的生長曲線。結(jié)果顯示，缺失株和回補株的生長曲線與親本株大致相同，說明缺失株和回補株均具有較好的生長趨勢，但它們在同一時間點的OD600nm值均低于親本株。表明BspG基因缺失株的體外生長能力被顯著抑制，但BspG基因回補之后的回補菌株并未達到親本株的生長水平。推測可能是由于BspG是親本株染色體上的基因，而pBspG是通過重組質(zhì)?；匮a的BspG基因，又經(jīng)過Kan+、AMP+抗性的篩選， 可能會致BspG基因的回復(fù)不完全，而致BspG基因回補后并未完全恢復(fù)該回補株的生長特性?？梢夿spG基因的缺失對布魯氏菌的生長有一定的抑制作用。

布魯氏菌感染宿主的過程中，其對宿主細(xì)胞的粘附對其的感染非常重要[12]。本研究比較了BspG基因缺失株、回補株與親本株對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 的粘附與侵襲作用。結(jié)果顯示，ΔBspG、pBspG均與親本株的粘附與侵襲能力幾乎相同，表明BspG的缺失對布魯氏菌在RAW 細(xì)胞中的粘附與侵襲能力無影響。這與趙曉麗[13]、王震等[14]發(fā)現(xiàn)rirA基因缺失并未降低布魯氏菌對巨噬細(xì)胞的粘附與侵襲能力的結(jié)論基本一致。

rBCV 階段（感染后24 h～48 h）是布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的主要增殖階段，也是布魯氏菌釋放的必要階段。本研究發(fā)現(xiàn)在感染后24 h 內(nèi)ΔBspG和pBspG在RAW 264.7 細(xì)胞胞內(nèi)的活菌數(shù)量與親本株相比差異不明顯，而感染24 h 后ΔBspG的胞內(nèi)活菌數(shù)量開始極顯著低于親本株（P＜0.01），可見BspG的缺失確實減緩了布魯氏菌在rBCV 階段的增殖過程，這不利于布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存與增殖。VirB T4SS 的分泌蛋白VceC 可以結(jié)合ER 伴侶蛋白Grp78/BiP 并誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），引發(fā)炎癥，可能在rBCV的生成中起作用[15]。還有研究表明，布魯氏菌T4SS分泌的VceC、BspA、BspB、BspF 效應(yīng)蛋白可以協(xié)同作用來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的囊泡分泌轉(zhuǎn)運并促進布魯氏菌rBCV 階段的生存能力[15-16]。BspG 是否也和這些效應(yīng)蛋白作用類似，即參與rBCV 的生成及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的分泌性轉(zhuǎn)運過程，還有待大量研究去證實。

本研究構(gòu)建了BspG基因缺失株ΔBspG和回補株pBspG，并首次證實BspG基因的缺失可以降低布魯氏菌的胞內(nèi)生存能力，提示BspG可能是布魯氏菌侵染宿主的關(guān)鍵分子，在布魯氏菌的rBCV 階段發(fā)揮重要作用。本研究為探究BspG基因在布魯氏菌致病機理中的作用奠定基礎(chǔ)。