湯 波，劉 奇，呂帥陽，石 磊，王建華，徐慧敏，于萍萍，劉 飛，石艷麗，孫石靜*

（1.兆豐華生物科技（南京）有限公司北京生物醫(yī)藥科技中心，北京 102609；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；3.北京景達醫(yī)療器械有限公司，北京 100600）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease，PCVD）的主要病原，其在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[1]。疫苗免疫是預防PCVD 的主要手段。我國目前所用的PCV2 疫苗，主要是全病毒滅活抗原或PCV2 Cap 蛋白抗原，輔以不同類型的佐劑配制而成，具有一定的免疫效果[1]。但是，PCV2 疫苗免疫后多以體液免疫應答為主，誘導細胞免疫水平較低，為了能夠提高PCV2 疫苗免疫效力，國內(nèi)出現(xiàn)了眾多針對PCV2 疫苗的佐劑，免疫效果參差不齊。病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular pattems，PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（Damage associated molecular patterns，DAMPs）分別與模式識別受體結(jié)合后，啟動機體針對侵入病原體的免疫應答，誘發(fā)獲得性免疫反應能力，抵抗微生物感染，PAMPs 和DAMPs 相關(guān)的成分是免疫佐劑的重要材料[2-3]。為提高PCV2 Cap 蛋白疫苗誘導機體的細胞免疫和體液免疫反應，本研究選用了5 種PAMPs、DAMPs 相關(guān)的分子和1 種細胞因子作為免疫增強添加調(diào)節(jié)劑，包括Poly I:C、R848、單磷酰脂質(zhì)A（MPLA）、皂素QuilA、QS21和白細胞介素2（IL-2），分別與PCV2 Cap 蛋白制備疫苗，免疫小鼠后評價6 種調(diào)節(jié)劑對PCV2 亞單位疫苗免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 Sf9 細胞由中科院微生物所提供；PCV2 Cap 重組桿狀病毒、效檢用PCV2 DBN SX07 株均由兆豐華生物科技（南京）有限公司北京生物醫(yī)藥科技中心制備保存。SFMpro 培養(yǎng)基購自深圳壹生科有限公司；DEAE 凝膠FF 購自武漢匯研生物技術(shù)有限公司；IL-2 由偉杰信公司提供；ISA15A 購自法國SEPPIC 公司；皂素QS21 購自美國萬諾公司；皂素QuilA、聚肌胞（Poly I:C）和MPLA，均購自Sigma-Aldrich 公司；Vc 購自麥克林公司；雷西莫特R848 購自西亞試劑；牛血清白蛋白（BSA）購自澳大利亞Bovogen 生物制品公司；MILLIPLEX?MAP 細胞因子檢測試劑盒購自Merck 公司；PCV2 型ELISA 抗體檢測試劑盒購自韓國金諾公司；商品疫苗（Con-V）購自國內(nèi)某公司；PCV2 單克隆抗體購自KPL 公司；羊抗鼠IgG-HRP 購自碧云天生物科技有限公司；18 g～22 g BALB/c 小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 疫苗制備 將經(jīng)鑒定后的PCV2 Cap 重組桿狀病毒按MOI 1.5 接種于Sf9 細胞，培養(yǎng)96 h 后收獲上清，經(jīng)50 ku 超濾濃縮-離子交換柱層析分離純化。純化后的PCV2 Cap 蛋白進行SDS-PAGE 分析，同時采用灰度分析測定蛋白濃度。純化蛋白進一步經(jīng)western blot 進行特異性鑒定后，將PCV2 Cap 蛋白（終濃度30 μg/mL）分別與IL-2（終濃度20 μg/mL）、Poly I:C（終濃度100 μg/mL）、R848（終濃度100 μg/mL）、Quil-a（終濃度20 μg/mL）、QS21（終濃度20 μg/mL）、MPLA（終濃度20 μg/mL）混勻制備含不同免疫調(diào)節(jié)劑的PCV2 Cap 蛋白抗原混合液，按照15%（V/V）比例將ISA 15A 佐劑分別添加至上述Cap 蛋白抗原混合液中，乳化制備6種疫苗，每2 mL 疫苗含PCV2 Cap 蛋白60 μg。同時制備不含免疫調(diào)節(jié)劑的ISA 15A 佐劑Cap 蛋白亞單位疫苗。

1.3 小鼠免疫及樣品采集 將18 g～22 g BALB/c 小鼠120 只隨機分為10 組，每組12 只，第1 組為非免疫對照組（Control 組），第2 組為純Cap 蛋白免疫對照組（Cap 組），第3 組為ISA 15A 佐劑Cap 蛋白亞單位疫苗對照組（15A 組），第4 組～第9 組為復合佐劑疫苗免疫組，依次IL2 組、Poly I:C 組、R848 組、QuilA組、QS21 組、MPLA 組，第10 組為商品疫苗免疫對照組（Con-V 組），第2 組～第10 組小鼠采用背部皮下接種方式，以相應疫苗0.5 mL/只免疫，首免后14 d以相同方法加強免疫，首免后7 d、21 d、28 d，各組小鼠隨機選取10 只經(jīng)眼眶采血分離血清。

1.4 小鼠安全性監(jiān)測 疫苗首免后連續(xù)觀察7 d，記錄各組小鼠狀態(tài)。首免后0、7 d，分別對各組小鼠體質(zhì)量進行稱量，計算相對增重。

1.5 小鼠血清PCV2 抗體ELISA 檢測 將1.3 中采集的各組小鼠血清1：100 倍稀釋后加入到酶標板中，利用PCV2 型ELISA 抗體檢測試劑盒對各組小鼠首免后第21 d、28 d 血清進行抗體檢測。

1.6 小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12 檢測 采集各組小鼠首免后第7 d 血清，每份100 μL，采用MILLIPLEX?MAP 細胞因子檢測試劑盒定量檢測，分析血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12 含量。

1.7 小鼠攻毒及病毒血癥檢測 首免后28 d，用效檢PCV2 DBN SX07 株對各組小鼠按0.5 mL/只（病毒含量為1×106.0TCID50/mL）進行腹腔注射攻毒，攻毒后21 d 眼眶采集抗凝血，采用PCR 方法檢測PCV2 病毒血癥。PCV2 特異性PCR 檢測引物為F：5'-CACGGA TATTGTAGTCCTGGT-3'/R： 5'-CCGCACCTTCGGATA TACTGTC-3'，反應條件為95 ℃5 min；95 ℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。預計擴增目的片段494 bp。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2 Cap蛋白制備結(jié)果 PCV2 Cap桿狀病毒接種Sf9 細胞后收集培養(yǎng)液經(jīng)濃縮純化后，進行SDSPAGE 電泳檢測及灰度分析測定結(jié)果顯示，檢測到與預期一致的28 ku 目的條帶，蛋白濃度為123 μg/mL（圖1A）。Western blot 特異性鑒定結(jié)果顯示該蛋白為PCV2 特異性蛋白（圖1B）。表明得到了PCV2 特異性Cap蛋白，可用于疫苗制備。

圖1 PCV2 Cap蛋白鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of PCV2 Cap protein

2.2 免疫小鼠安全性觀察結(jié)果 疫苗免疫小鼠7 d內(nèi)觀察記錄各組小鼠狀態(tài)，結(jié)果顯示，除Control 組小鼠外，其他各組小鼠在疫苗接種后均出現(xiàn)被毛雜亂、潤濕現(xiàn)象，72 h 內(nèi)全部恢復正常；觀察期內(nèi)各組小鼠積極采食，活動迅速；小鼠注射局部未觀察到潰爛、脫毛癥狀。對小鼠體質(zhì)量進行監(jiān)測，結(jié)果顯示15A 組、IL-2 組、Poly I:C 組、R848 組、QuilA組、MPLA 組的體質(zhì)量相對增重值比Control 組大，Cap 組、QS21 組和Con-V 組的體質(zhì)量相對增重值比Control 組小，但均不顯著（P＞0.05）（圖2）。上述結(jié)果表明，各免疫增強劑對小鼠安全性良好。

圖2 免疫后7 d各組小鼠體質(zhì)量相對增重值Fig.2 The relative weight gain of mice at 7 days post immunization

2.3 免疫小鼠血清PCV2 抗體ELISA 檢測結(jié)果 各組小鼠分別于首后21 d、28 d 采集血清，經(jīng)ELISA 抗體檢測試劑盒檢測PCV2 特異性抗體。結(jié)果顯示，首免后21 d、28 d Control 組小鼠未檢出PCV2 特異性抗體；首免后21 d，試驗佐劑組小鼠之間抗體水平差異不顯著（P＞0.05），其中IL-2 組、QuilA 組和MPLA 組小鼠均高于其他試驗佐劑組，IL-2 組和QuilA 組與Cap 組和15A 組比較差異顯著（P≤0.05），試驗佐劑組與商品疫苗（Con-V）比較，差異不顯著（P＞0.05）；首免后28 d，試驗佐劑組與15A 組和Con-V 組比較，差異均不顯著（P＞0.05），各試驗佐劑組之間抗體水平差異不顯著（P＞0.05），所有疫苗免疫組與Cap 組比較，均存在顯著性差異（P≤0.05）（圖3）。上述結(jié)果表明，試驗佐劑IL-2、QuilA 均能夠顯著提高Cap亞單位疫苗免疫小鼠后抗體水平，且略高于商品對照疫苗。

圖3 免疫后21 d和28 d各組PCV2抗體水平的檢測Fig.3 The level of antibody against PCV2 at 21 dpi and 28 dpi

2.4 免疫小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12細胞因子檢測結(jié)果 各組小鼠免疫后7 d，采集血清，利用MILLIPLEX?MAP 試劑盒定量分析各細胞因子表達量。IFN-γ 檢測結(jié)果顯示，6 個試驗佐劑組與Control 組和Cap 組比較，MPLA 組小鼠血清中IFN-γ 的表達量顯著提高（P≤0.05），R848 組IFN-γ表達量低于15A 組、Con-V 組、Control 組和Cap 組，MPLA 組IFN-γ 表達量顯著高于R848 組（P≤0.05），MPLA 組與其他幾個佐劑組間IFN-γ 表達量差異不顯著（P＞0.05）；IL-2組、Poly I:C組、QuilA組、QS21組、MPLA 組IFN-γ 表達量高于15A 組和Con-V 組，但差異不顯著（圖4A）。

TNF-α 檢測結(jié)果顯示，6 個試驗佐劑組均能提高小鼠血清中TNF-α 的表達量。R848 組和QS21 組小鼠血清中TNF-α 表達量顯著高于Control 組和Cap 組（P≤0.05），6 個試驗佐劑組TNF-α 表達量高于15A 組和Con-V 組，但僅QS21 組與15A組和Con-V組差異顯著（P≤0.05），而且QS21 組與其他幾個佐劑組也存在顯著差異（P≤0.05，圖4B）。

IL-2檢測結(jié)果顯示，IL-2組、R848組、QuilA組、QS21 組、MPLA 組小鼠血清中IL-2 表達量均高于4 個對照組（Control 組、15A 組、Con-V 組和Cap 組），其中MPLA 組和QS21 組顯著高于各對照組（P≤0.05），且QS21 組和MPLA 組IL-2 表達量顯著高于Poly I:C 組（P≤0.05，圖4C）。

IL-4檢測結(jié)果顯示，各實驗組小鼠血清中IL-4表達量提高均不明顯，僅MPLA組顯著高于Cap組、Con-V組、Control組和QS21組（P≤0.05），而IL-2組和R848組IL-4 表達量低于MPLA 組但高于各對照組（圖4D）。

IL-6檢測結(jié)果顯示，試驗佐劑IL-2 組、R848 組和MPLA 組小鼠血清中IL-6 表達量顯著高于各對照組和其他試驗佐劑組，但上述3 組之間差異不顯著，其中MPLA 組的IL-6 濃度最高，顯著高于4 個對照組和其他3個試驗佐劑組（P≤0.05，圖4E）。

IL-12檢測結(jié)果顯示，MPLA組小鼠血清中IL-6表達量極顯著高于各對照組和4 個試驗佐劑組（IL-2 組、QuilA 組、QS21 組、Poly I:C 組）（P≤0.01），而顯著高于R848 組（P≤0.05）；除MPLA 外，其余各組IL-12 表達量與各對照組，以及各佐劑組之間比較差異不顯著（圖4F）。

圖4 各組免疫小鼠血清中IFN-γ（A）、TNF-α（B）、IL-2（C）、IL-4（D）、IL-6（E）、IL-12（F）的表達水平Fig.4 The expression level of IFN-γ(A),TNF-α(B),IL-2(C),IL-4(D),IL-6(E)and IL-12(F)

上述結(jié)果表明，MPLA、QS21、R848、IL-2 對機體細胞免疫應答具有明顯的提升效果，且顯著優(yōu)于商品疫苗（Con-V）和對照佐劑組（15A）。

2.5 各組小鼠攻毒后病毒血癥檢測結(jié)果 對各組小鼠PCV2 攻毒后21 d 采集全血，采用PCR 方法進行病毒血癥檢測。結(jié)果顯示，control 組小鼠PCV2 病毒血癥檢出率為100%（12/12），Cap 組PCV2 病毒血癥檢出率為33.3%（4/12），15A 組PCV2 病毒血癥檢出率為16.7%（2/12），其他各組全血均未檢出PCV2 陽性。結(jié)果表明，6 組試驗佐劑疫苗均能有效抑制PCV2 感染后小鼠病毒血癥的產(chǎn)生，免疫效果與商品疫苗組一致。

3 討 論

PCV2 Cap 蛋白是目前PCV2 疫苗研究中使用最為廣泛的抗原蛋白，該蛋白易于在不同表達系統(tǒng)內(nèi)表達生產(chǎn)，形成VLP 顆粒，具有與天然構(gòu)象相似的免疫原性[3]，易于被機體識別并遞呈，本研究以桿狀病毒表達的PCV2 Cap 蛋白作為靶抗原，配制含有不同免疫增強劑的疫苗，免疫小鼠后觀察到免疫早期小鼠均出現(xiàn)被毛雜亂現(xiàn)象，分析原因可能與佐劑材料特點相關(guān)，本研究所選用的添加材料包含Toll 樣受體配體和NOD 樣受體配體，屬于病原相關(guān)分子和損傷相關(guān)分子[2]，能夠非特異性刺激機體固有免疫應答，對該類物質(zhì)的后期研究需進一步優(yōu)化使用量，完善安全性與效力的平衡點。

MPLA 是一種TLR4 受體的激動劑，是脂多糖（Lipopolysacchride，LPS）脂質(zhì)A 的低毒衍生物，其保留了母體分子免疫活性的脂質(zhì)A 部分[4]，能夠減少炎性細胞因子的產(chǎn)生。MPLA 作為免疫佐劑可與眾多疫苗配伍，MPLA 用于人用疫苗，預防HPV 的感染[5]；MPLA 應用于狂犬病疫苗，促進了抗體的產(chǎn)生[6]。本研究中MPLA 提升細胞免疫應答效果最明顯，能夠顯著提高IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12 等細胞因子的表達水平，同時體液免疫水平也高于對照組，該免疫增強劑可以做備選佐劑配方進一步研究。

QS21 和QuilA 均是來源于南美皂樹的皂苷分離物，作為佐劑[7]被廣泛應用于多種獸用疫苗中，也被用于人醫(yī)與獸醫(yī)共用的免疫學研究，QuilA 常被制備成免疫刺激復合物（ISCOMs）用于疫苗免疫增強作用[8]， QS21 可誘發(fā)Th1 極化免疫反應[9-11]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QS21 能夠顯著提高TNF-α 表達水平，QuilA 對TNF-α 因子有較高水平的誘導，表明該佐劑在免疫初期能夠激發(fā)機體較強的炎癥反應，能夠提高免疫初期細胞免疫水平。

Poly I:C 是雙鏈RNA 的類似物，可以識別TLR3受體，是一種干擾素誘導劑。黃艷艷等證實不同長度的Poly I:C 均能激活雞體固有免疫應答，引起IFN-γ、IL-2、IL-6 等細胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[12]；Payvand 等證實Poly I:C 可以通過局部和系統(tǒng)的途徑誘導天然免疫反應基因的表達[13]；王繼英等研究發(fā)現(xiàn)Poly I:C 的濃度和作用時間對豬外周血單核細胞基因表達有影響[14]。本研究中Poly I:C 能夠提升機體免疫應答水平，上調(diào)IFN-γ、IL-6 等因子表達水平，但效果不顯著。

咪唑喹啉類化合物是TLR7/8 的識別配體，R848屬于此類物質(zhì)，可以通過免疫細胞表面TLR7 信號通路激活強烈的抗病毒及抗腫瘤效應[15]，同時可以通過TLR7 促進樹突狀細胞分泌Ⅰ型干擾素以抵御病毒感。本研究中R848 在TNF-α、IL-6 的誘導表達中顯示較強優(yōu)勢，表明其在誘導機體早期細胞免疫應答中發(fā)揮重要作用。

細胞因子是T 細胞介導免疫應答通路中的關(guān)鍵因子，在動物疫苗佐劑應用中也有大量研究，常用細胞因子包括IL-2、IL-12 和IFN-γ 等，這些細胞因子通過不同的途徑促進機體Th1 類或Th2 類反應，調(diào)節(jié)免疫應答效果。IL-2 能夠調(diào)節(jié)T 細胞、B 細胞和NK 細胞等細胞的功能，增強機體體液和細胞免疫應答[16]。涂浩等研究發(fā)現(xiàn)，IL-2 和IFN-γ 能夠顯著提高口蹄疫合成肽疫苗的體液免疫和細胞免疫應答[17]。本研究中IL-2 添加后能夠顯著提高血清中PCV2 的ELISA 抗體水平，且略高于商品對照疫苗；對IFN-γ表達也具有上調(diào)作用，而且能夠顯著提高IL-6 和IL-4 的表達水平，表明IL-2 能夠提高PCV2 Cap 蛋白疫苗的體液免疫和細胞免疫應答。

本研究結(jié)果表明，MPLA、QS21 和IL-2 既能夠提高PCV2 Cap 蛋白亞單位疫苗免疫后機體抗體免疫應答水平，又能有效提高機體細胞免疫應答水平，對PCV2 亞單位疫苗的免疫增強效果明顯，可以作為該疫苗研究的候選佐劑組分。其中IL-2 更具有廣闊的應用前景，后續(xù)研究中需要進一步加強該物質(zhì)穩(wěn)定性研究。