冀夢瑤，周詩淼，蔣 卉，張瑩輝，彭小薇，李佩國，吳同壘*

（1.河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100080）

沙門菌是一種人獸共患病原菌，可感染多種畜禽，引起敗血癥和腸炎，導(dǎo)致懷孕動(dòng)物流產(chǎn)；也可感染人類，造成胃腸炎等，具有重要的公共衛(wèi)生意義[1-2]。沙門菌感染的防控主要依賴抗生素、檢疫凈化等措施，從近年來的執(zhí)行效果來看，成效遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。疫苗是解決沙門菌感染的重要途徑，利用基因工程技術(shù)對細(xì)菌遺傳物質(zhì)進(jìn)行改造，可獲得安全性和保護(hù)力良好的弱毒菌株[3]。沙門菌攜帶大量毒力相關(guān)因子，其中htrA和ssaV等是開發(fā)基因工程減毒活疫苗的靶基因[4]。研究顯示，缺失htrA和yncD基因的甲型副傷寒沙門菌株對小鼠的毒力顯著降低，滴鼻免疫能夠刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，具有一定的免疫保護(hù)效果；ssaV基因缺失可導(dǎo)致傷寒沙門菌和鼠傷寒沙門菌的毒力降低，且能對免疫小鼠提供良好的免疫保護(hù)效果[5]。研究結(jié)果顯示，與免疫野生菌株的雛雞相比較，免疫phoP和fllic基因缺失菌株雛雞病理損傷均明顯減輕，存活率均顯著提高[6-8]。甘油激酶K（GlpK），由glpK基因編碼，可影響志賀菌對上皮細(xì)胞的黏附與侵入，增強(qiáng)細(xì)菌的致病性，調(diào)控分枝桿菌、李氏桿菌的生物被膜形成和耐藥性[9]。另外，glpK基因在沙門菌感染的宿主胞內(nèi)外的表達(dá)水平差異顯著，提示其在沙門菌胞內(nèi)感染及其毒力中具有潛在作用[4]。

目前未見glpK基因?qū)δc炎沙門菌毒力的影響，及其缺失菌株作為疫苗候選株的研究報(bào)道。因此，本研究對腸炎沙門菌glpK缺失株進(jìn)行了模擬體內(nèi)應(yīng)激試驗(yàn)、巨噬細(xì)胞存活試驗(yàn)、小鼠感染及免疫保護(hù)試驗(yàn)，為沙門菌的致病機(jī)制和基因工程弱毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 腸炎沙門菌c50336 株和glpK基因缺失株c50336ΔglpK，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)單曉楓教授惠贈(zèng)；4 周齡～6 周齡BALB/c 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

DMEM、1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自賽默飛世爾科技有限公司；青、鏈霉素、慶大霉素購自北京亞米生物科技有限公司；MTT 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；ConA、TMB顯色液及羊抗鼠HRP-IgG 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 野生株和glpK基因缺失株的體外模擬應(yīng)激試驗(yàn) 將c50336 和c50336ΔglpK菌液分別以等體積pH3.5（酸性刺激）、pH10.0（堿性刺激）、含10 mmol/L H2O2（氧化應(yīng)激）和2.4 mol/L NaCl（高滲刺激）的生理鹽水重懸，37 ℃作用60 min，10 倍倍比稀釋后活菌計(jì)數(shù)。以細(xì)菌存活率=應(yīng)激后活菌數(shù)/原始活菌數(shù)，評價(jià)菌株對酸、堿、氧化和高滲應(yīng)激的抵抗能力。

1.3 野生株和glpK基因缺失株的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活試驗(yàn) 將狀態(tài)良好的鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7 鋪96孔細(xì)胞板；24 h 后，將c50336 和c50336ΔglpK菌液分別以MOI 100 感染，并加入含100 μg/mL 慶大霉素的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；分別在感染后1 h、10 h、24 h，使用1% Triton X-100 裂解巨噬細(xì)胞，10 倍倍比稀釋后細(xì)菌計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)菌株在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)的活菌數(shù)。

1.4 野生株和glpK基因缺失株對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）測定 將4 周齡～6 周齡BALB/c 雌鼠分為11組，5 只/組，其中5 組為野生株感染，5 組為缺失株感染，1 組為對照組。采用腹腔注射方式感染小鼠，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，菌株c50336 分別以1.5×106cfu/只～1.5×102cfu/只感染小鼠，菌株c50336ΔglpK分別以2.1×109cfu/只～2.1×105cfu/只感染小鼠。對照組小鼠注射等體積TSB 液體培養(yǎng)基。記錄14 d 內(nèi)小鼠的死亡情況。采用寇氏法計(jì)算菌株對小鼠的LD50。

1.5glpK基因缺失株的免疫保護(hù)試驗(yàn) 將4 周齡～6 周齡BALB/c 雌鼠分為3 組，每組25 只，分別為免疫組、攻菌組和對照組。免疫組小鼠經(jīng)腹腔注射菌株c50336ΔglpK，劑量為2.1×106cfu/只；攻菌組和陰性對照組小鼠腹腔注射TSB 培養(yǎng)基；14 d 后二免。首免后28 d，對免疫組和攻菌組小鼠分別經(jīng)腹腔注射菌株c50336，劑量為1.5×105cfu/只。對照組注射TSB 液體培養(yǎng)基。記錄15 d 內(nèi)小鼠的死亡情況。

1.6glpK基因缺失株免疫小鼠后的脾臟指數(shù)及脾臟載菌量的測定 將4 周齡～6 周齡BALB/c 雌鼠分為2 組，每組15 只；一組為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)腹腔注射菌株c50336ΔglpK，劑量為2.1×106cfu/只；另一組為對照組，注射等體積的TSB 液體培養(yǎng)基。分別在注射后3 d、10 d 和21 d，取5 只小鼠，稱重、眼球采血分離血清；同時(shí)取脾臟稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟重量/小鼠體質(zhì)量×100%。將脾臟勻漿，10 倍倍比稀釋后細(xì)菌計(jì)數(shù)，測定各組小鼠脾臟載菌量。

1.7 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測 將菌株c50336ΔglpK利用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，PBS 洗滌，超聲破碎，離心取上清，即為全菌蛋白，經(jīng)BCA 試劑盒檢測蛋白濃度為1.28 mg/mL。

參照文獻(xiàn)[7]分別將免疫后3 d、10 d 和21 d 的各5 只小鼠脾臟制備成脾淋巴細(xì)胞懸液，鋪96 孔細(xì)胞板，每只小鼠脾細(xì)胞鋪9 孔，分別利用ConA 和c50336ΔglpK全菌蛋白刺激，濃度均為5 μg/mL。同時(shí)設(shè)置未刺激的陰性對照組。72 h 后，向培養(yǎng)孔避光加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；加入100 μL Formazan 溶解液，培養(yǎng)4 h，測定OD570nm，評估各組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力。

采用增殖指數(shù)評估脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，增殖指數(shù)的計(jì)算公式為：ConA 組=（ConA 組OD570nm均值-培養(yǎng)基組OD570nm均值）/（未刺激組OD570nm均值-培養(yǎng)基組OD570nm均值）；全菌蛋白組=（全菌蛋白組OD570nm均值-培養(yǎng)基組OD570nm均值）/（未刺激組OD570nm均值-培養(yǎng)基組OD570nm均值）。

1.8glpK基因缺失株免疫小鼠抗體水平的間接ELISA 檢測 取1.7 制備的c50336ΔglpK全菌蛋白，以1 000 ng/孔、37 ℃包被2 h；PBST 洗滌， 5%脫脂乳4 ℃封閉過夜；以小鼠血清（1：100）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1：5 000）為二抗，經(jīng)間接ELISA 檢測小鼠血清抗體水平。

2 結(jié) 果

2.1 野生株和glpK基因缺失株的體外模擬應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果 分別以pH3.5、pH10.0、含10 mmol/L H2O2和含2.4 mol/L NaCl 的生理鹽水孵育菌株c50336 和c50336ΔglpK，計(jì)算各組菌的存活率。結(jié)果顯示，相比于c50336，缺失菌株c50336ΔglpK在氧化和高滲環(huán)境環(huán)境中的存活率均極顯著降低（0.001＜P＜0.01），但在酸性和堿性環(huán)境中的存活率均無差異（圖1）。表明GlpK 參與腸炎沙門菌對氧化和高滲環(huán)境的抵抗能力。

圖1 缺失菌株的環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of environmental stress test for the mutant

2.2 野生株和glpK基因缺失株的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活試驗(yàn)結(jié)果 將c50336 和c50336ΔglpK菌株分別以MOI 100 感染鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7，分別在感染后1 h、10 h、24 h 裂解細(xì)胞，細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，感染后10 h 和24 h，野生菌株c50336 胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)明顯高于缺失菌株c50336ΔglpK（圖2）。結(jié)果表明，glpK基因缺失降低了腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力。

圖2 缺失菌株的胞內(nèi)存活試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Intracellular survival test of the mutant

2.3 野生株和glpK基因缺失株的LD50測定結(jié)果將不同劑量的c50336 和c50336ΔglpK分別經(jīng)腹腔注射小鼠，記錄14 d 內(nèi)小鼠的死亡情況，并對死亡小鼠剖檢和細(xì)菌的再分離鑒定，并采用寇氏法計(jì)算菌株對小鼠的LD50。經(jīng)計(jì)算結(jié)果顯示，菌株c50336 和c50336ΔglpK的LD50分別為6.7×102cfu 和1.6×107cfu（表1）。對各組死亡小鼠剖檢，細(xì)菌的再分離結(jié)果顯示，獲得的菌株與小鼠腹腔攻菌使用的菌株一致。結(jié)果顯示，小鼠脾臟腫大，且顏色變深，癥狀符合預(yù)期。結(jié)果表明：glpK基因的缺失導(dǎo)致腸炎沙門菌的毒力顯著下降。

表1 缺失菌株對小鼠的LD50測定結(jié)果Table 1 Results of LD50 test for the mutant to mice

2.4glpK基因缺失株的免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 將缺失菌株c50336ΔglpK經(jīng)腹腔注射免疫小鼠2 次，首免后28 d 經(jīng)腹腔感染菌株c50336，統(tǒng)計(jì)15 d內(nèi)各組小鼠的免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，攻菌組小鼠出現(xiàn)震顫，被毛直立、凌亂，蜷縮一起，攻菌后的12 d 內(nèi)陸續(xù)死亡、并最終全部死亡；免疫組小鼠攻菌后，也有部分小鼠出現(xiàn)上述癥狀，但最終恢復(fù)，15 d 內(nèi)未見死亡，免疫保護(hù)率為100%；陰性對照組小鼠未出現(xiàn)上述臨床癥狀，且未見死亡（圖3）。表明glpK基因缺失株的免疫保護(hù)效果良好。

圖3 缺失菌株對小鼠的免疫保護(hù)率Fig.3 Immune protection rate of the mutant strain

2.5 免疫小鼠脾臟指數(shù)及載菌量檢測結(jié)果 將c50336 ΔglpK免疫小鼠后3 d、10 d 和21 d 分別對各組小鼠稱重后，迫殺取脾臟稱重，并計(jì)算脾臟指數(shù)。將脾臟組織勻漿，10 倍倍比稀釋后經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)，測定載菌量。結(jié)果顯示，免疫組小鼠脾臟指數(shù)均極顯著高于對照組（P＜0.01，P＜0.001），且在免疫后10 d 脾臟指數(shù)最高（圖4A）；免疫組小鼠脾臟載菌量逐漸降低，并在21 d 時(shí)為零；對照組小鼠脾臟始終無細(xì)菌檢出（圖4B）。表明glpK基因缺失株在小鼠體內(nèi)不能形成持續(xù)感染，最終被機(jī)體清除，安全性良好。

圖4 免疫小鼠脾臟指數(shù)（A）及脾臟載菌量（B）的檢測結(jié)果Fig.4 Detection of spleen index(A)and bacterial load(B)in mice

2.6 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力及血清抗體水平檢測 分別將小鼠免疫c50336ΔglpK后3 d、10 d 和21 d 的脾臟研磨后，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，分別經(jīng)c50336ΔglpK全菌蛋白刺激后計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)。結(jié)果顯示，全菌蛋白刺激的小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)均極顯著高于未刺激組（0.001＜P＜0.01），且隨免疫次數(shù)的增加，該增殖指數(shù)也隨之升高。陽性對照ConA 刺激的小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)高于全菌蛋白刺激組和極顯著高于（P＜0.01）未刺激組（圖5A）。結(jié)果表明glpK基因缺失株可增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，并產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

分別在免疫后3 d、10 d 和21 d 采血分離血清，采用間接ELISA 法檢測血清中的抗體水平。結(jié)果顯示，免疫組小鼠血清中的抗體水平隨免疫次數(shù)的增加而持續(xù)上升（圖5B）。表明glpK基因缺失株可刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。

圖5 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力（A）和血清抗體水平檢測（B）結(jié)果Fig.5 Detection of lymphocyte proliferation ability(A)and serum antibody level(B)in mice

3 討 論

甘油激酶GlpK 的功能研究主要集中在其對細(xì)菌甘油代謝作用的影響方面，而對其影響細(xì)菌毒力方面的研究較少。沙門菌進(jìn)入機(jī)體后，需抵御一系列來自機(jī)體體液或吞噬細(xì)胞的殺傷作用，其作用方式主要包括氧化、酸及滲透壓應(yīng)激等[10-12]。研究表明，沙門菌胞內(nèi)感染過程中g(shù)lpK基因表達(dá)量的變化顯著，提示其可能與沙門菌胞內(nèi)存活的機(jī)制有關(guān)[13-14]。本研究利用glpK基因缺失株c50336ΔglpK進(jìn)行模擬體外應(yīng)激試驗(yàn)證明GlpK 參與了腸炎沙門菌的抗氧化和抗高滲機(jī)制。

研究顯示，與病原菌代謝相關(guān)的基因往往影響其毒力，例如與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因fur、putA和feuABC等，與糖類代謝相關(guān)的基因ABC transpoter、nagC和glmS等[15-18]。GlpK 可將進(jìn)入菌體的甘油磷酸化，形成α-磷酸甘油，最終進(jìn)入糖酵解過程，參與細(xì)菌能量代謝，同時(shí)參與細(xì)菌細(xì)胞壁中脂類的合成，進(jìn)而影響細(xì)菌的粘附等致病過程[19]。據(jù)此，推測GlpK 可能影響沙門菌的胞內(nèi)存活能力和毒力，本研究利用巨噬細(xì)胞存活試驗(yàn)和對小鼠的LD50試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)glpK基因缺失株c50336ΔglpK在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力顯著降低，而對小鼠的LD50顯著升高，表明缺失菌株c50336ΔglpK對小鼠的毒力明顯降低。

利用同源重組或者其他相關(guān)技術(shù)敲除病原菌的毒力基因獲得基因缺失弱毒株，是構(gòu)建基因工程減毒活疫苗的重要方式。小鼠的免疫攻菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫c50336ΔglpK后對免疫小鼠可以提供100%的抵抗野生菌株感染的能力。研究認(rèn)為，機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)對機(jī)體抵抗沙門菌的感染更為重要[20]。體液免疫在沙門菌感染的早期不能發(fā)揮免疫清除作用，但在感染后期和持續(xù)性感染過程中發(fā)揮了重要的免疫防御作用[21]。本研究利用MTT 法檢測了c50336ΔglpK免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，并利用間接ELISA 檢測免疫小鼠的血清抗體水平，結(jié)果表明，glpK基因缺失株可有效增強(qiáng)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力和誘導(dǎo)小鼠血清產(chǎn)生較高的抗體水平，即刺激小鼠產(chǎn)生了良好的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果首次證明GlpK 影響腸炎沙門菌的毒力，glpK基因缺失菌株能夠?yàn)樾∈筇峁┝己玫拿庖弑Ｗo(hù)效果，具有作為防御腸炎沙門菌感染的候選疫苗株的潛力。本研究結(jié)果豐富了腸炎沙門菌的致病機(jī)制理論，并為其疫苗的研究提供了重要試驗(yàn)參考。