黃賽賽，孫玥，陳子嫣，梁軍，趙成(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南京 210008)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性自身免疫性疾病[1]，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。胞外誘捕網(wǎng)(extracellular traps, ETs)是由雙鏈DNA、蛋白酶、組蛋白和抗菌肽等結(jié)構(gòu)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最早于2004年在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)，活化的中性粒細(xì)胞可以通過(guò)形成NETs捕獲并殺滅病原菌，這種死亡方式稱為NETosis[2]。最近研究表明，除中性粒細(xì)胞，其他免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等也可形成胞外誘捕網(wǎng)[3]。巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(macrophageextracellular traps，METs)的組分包括瓜氨酸化組蛋白H3(citrullinated histone H3，CH3)、髓過(guò)氧化物酶等[4]。METs的形成與活性氧及肽?；彼崦搧啺访?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)等相關(guān)，在感染、急性腎損傷等疾病中發(fā)揮重要作用[5-6]?；な荝A常累及的部位之一，RA滑膜中含有豐富的巨噬細(xì)胞，RA滑膜巨噬細(xì)胞是否存在METs及其可能發(fā)揮的作用目前仍未可知。本研究通過(guò)檢測(cè)RA患者滑膜中巨噬細(xì)胞的極化和METs形成情況，探討RA中是否存在METs的表達(dá)異常，為后續(xù)研究METs在RA發(fā)病和治療中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2020年11月至2021年5月就診于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院的5例RA患者，RA診斷均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)制定的RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，排除急性感染、腫瘤和其他確定的自身免疫病。5例RA組患者中包括4例女性和1例男性，年齡(56.0±5.7)歲，病程(13.0±3.8)年，28個(gè)關(guān)節(jié)的疾病活動(dòng)度評(píng)分DAS28(4.0±0.3)分。同時(shí)選取5例創(chuàng)傷患者作為對(duì)照組，包括4例女性和1例男性，年齡(55.0±6.4)歲。兩組間性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。取所有研究對(duì)象膝關(guān)節(jié)新鮮滑膜組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文件號(hào)2021-544-01)，患者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器 蘇木精-伊紅(HE)染液(南京建成公司)，胎牛血清、牛血清蛋白(BSA)、0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)，Triton-100、DAPI(上海碧云天生物公司)，多聚甲醛(武漢谷歌公司)，兔抗人F4/80、兔抗人CD86、兔抗人CD206、兔抗人H2A抗體(美國(guó)eBioscience公司)，RIPA蛋白裂解液(美國(guó)CST公司)，磷酸酶抑制劑(中國(guó)凱基公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF，美國(guó)Sigma公司)，PAD4抗體、CH3抗體、GAPDH抗體(美國(guó)Proteintech公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、Alexa Flour 488、Alexa Flour 555標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國(guó)ImmunoWay公司)。FSX100生物導(dǎo)航儀(日本Olympus公司)，Western Blot凝膠成像儀(英國(guó)Syngene公司)，SDS-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.3人滑膜細(xì)胞分離 將1 cm2組織塊放入平皿中，漂洗后用剪刀將組織剪至1 mm2勻漿狀并置于離心管中，加入Ⅱ型膠原酶和等體積的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化60 min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化后過(guò)濾收集細(xì)胞懸液，1 300 r/min離心5 min除去細(xì)胞碎片。

1.4HE染色 收集滑膜組織，用4%的多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水透明、浸蠟包埋、切片和貼片、脫蠟和水化制備常規(guī)切片，將制作好的切片置于蘇木紫溶液中染色10 min，用蒸餾水洗掉多余的液體，用1%鹽酸酒精處理數(shù)秒鐘，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出藍(lán)紫色后用蒸餾水充分洗滌，再用1%氨水處理數(shù)秒鐘，至切片返藍(lán)后再用蒸餾水充分洗滌；用1%伊紅繼續(xù)染色3 min，染色后的切片再次進(jìn)行脫水和透明操作后即可封片；顯微鏡下觀察標(biāo)本并攝片保存。

1.5免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，1% Triton-100破膜20 min，滴加含3%BSA和含10%正常山羊血清的PBS各250 μL，濕盒內(nèi)4 ℃反應(yīng)1 h；輕輕倒去反應(yīng)液，然后分別滴加一抗，如兔抗人F4/80、兔抗人CD86、兔抗人CD206、兔抗人H2A抗體(1∶150稀釋)，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，4 ℃濕盒反應(yīng)過(guò)夜；PBS清洗3次，滴加Alexa Flour 488、Alexa Flour 555標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶200稀釋)及DAPI，4 ℃濕盒避光反應(yīng)1 h；PBS沖洗3次，抗熒光猝滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。運(yùn)用免疫熒光法分別檢測(cè)連續(xù)切片中F4/80、CD86、CD206、H2A的表達(dá)水平。當(dāng)一抗為兔抗人F4/80、二抗為Alexa Flour 488標(biāo)記羊抗兔IgG時(shí)，F(xiàn)4/80染色陽(yáng)性(綠色)代表巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。當(dāng)一抗為兔抗人CD86、二抗為Alexa Flour 488標(biāo)記羊抗兔IgG，一抗為兔抗人F4/80、二抗為Alexa Flour 555標(biāo)記羊抗兔IgG時(shí)，F(xiàn)4/80陽(yáng)性(紅色)巨噬細(xì)胞中CD86陽(yáng)性(綠色)細(xì)胞即M1型巨噬細(xì)胞。當(dāng)一抗為兔抗人CD206、二抗為Alexa Flour 488標(biāo)記羊抗兔IgG，一抗為兔抗人F4/80、二抗為Alexa Flour 555標(biāo)記羊抗兔IgG時(shí)，F(xiàn)4/80陽(yáng)性(紅色)巨噬細(xì)胞中CD206陽(yáng)性(綠色)細(xì)胞即M2型巨噬細(xì)胞。當(dāng)一抗為兔抗人H2A、二抗為Alexa Flour 555標(biāo)記羊抗兔IgG，一抗為兔抗人F4/80、二抗為Alexa Flour 488標(biāo)記羊抗兔IgG時(shí)，F(xiàn)4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞(綠色)中H2A染色陽(yáng)性(紅色)表明METs形成。采用Image J軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目以及共定位的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量化和統(tǒng)計(jì)。對(duì)雙染細(xì)胞的共定位進(jìn)行皮爾斯相關(guān)系數(shù)的分析(1表示完全相關(guān)，0表示隨機(jī)分布，-1表示完全排除)。

1.6蛋白免疫印跡法 收集制備好的滑膜組織懸液，加入適量蛋白裂解液(RIPA蛋白裂解液1 mL+磷酸酶/蛋白酶抑制劑10 μL+PMSF 10 μL)，置于冰上，于搖床上裂解30 min，確保細(xì)胞充分裂解；12 000×g離心20 min，取上清液，用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)所測(cè)樣本蛋白質(zhì)濃度，用蛋白裂解液將各樣本濃度調(diào)為相同，加入1/4體積的5×loading buffer，100 ℃加熱樣本10 min使蛋白質(zhì)變性。向聚丙烯酰胺凝膠中每孔加入20～30 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，洗滌后加入封閉液室溫封閉1 h，洗膜后分別與相應(yīng)的一抗PAD4抗體、CH3抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。TBST洗膜3～4次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫反應(yīng)1 h后再用TBST洗膜3～4次，加入顯影液，曝光拍照。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，分別檢測(cè)PAD4抗體、CH3的表達(dá)。采用Image J軟件對(duì)獲取的蛋白質(zhì)條帶圖像進(jìn)行吸光度測(cè)定，以目的蛋白質(zhì)與GAPDH內(nèi)參蛋白吸光度值比值作為目的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。連續(xù)變量數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RA患者滑膜巨噬細(xì)胞明顯增多 與對(duì)照組相比，RA組滑膜細(xì)胞僅少量形態(tài)正常，可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1A。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果示RA組滑膜組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，其中DAPI染色陽(yáng)性(藍(lán)色)代表細(xì)胞核，F(xiàn)4/80染色陽(yáng)性(綠色)代表巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。RA組的巨噬細(xì)胞數(shù)(98±7.09)顯著高于對(duì)照組(10±1.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.24，P<0.001)。

注：A，正?；づc滑膜炎組織的HE染色結(jié)果(20×，標(biāo)尺為100 μm)；B，巨噬細(xì)胞在正?；づc滑膜炎組織中的免疫熒光表達(dá)的代表性圖片(n=5)，藍(lán)色是細(xì)胞核(DAPI)，綠色是F4/80，標(biāo)尺為100 μm。

2.2RA患者滑膜巨噬細(xì)胞向M1極化增多 結(jié)果顯示RA患者滑膜中M1型巨噬細(xì)胞的共定位系數(shù)較正常對(duì)照組顯著增多(0.78±0.022 vs 0.13±0.011，t=26.16，P<0.001)，兩組間M2型巨噬細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.23±0.019 vs 0.18±0.012，t=1.81，P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A，巨噬細(xì)胞在正?；づc滑膜炎組織中M1極化的免疫熒光表達(dá)的代表性圖片(n=5)，藍(lán)色是細(xì)胞核(DAPI)，綠色是CD86，紅色是F4/80，標(biāo)尺為100 μm；B，巨噬細(xì)胞在正?；づc滑膜炎組織中M2極化的免疫熒光表達(dá)的代表性圖片(n=5)，藍(lán)色是細(xì)胞核(DAPI)，綠色是CD206，紅色是F4/80，標(biāo)尺為100 μm。

2.3RA患者滑膜巨噬細(xì)胞METs形成顯著增多 激光共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)，RA組滑膜組織中部分巨噬細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)解聚，導(dǎo)致DNA釋放到胞外，其中H2A染色陽(yáng)性(紅色)表明METs形成，藍(lán)色是細(xì)胞核(DAPI)，綠色為F4/80。RA組F4/80陽(yáng)性H2A陽(yáng)性細(xì)胞共定位系數(shù)(0.65±0.023)顯著高于對(duì)照組(0.18±0.012)(t=19.8，P<0.001)。見(jiàn)圖3。

注：巨噬細(xì)胞誘捕網(wǎng)在正?；づc滑膜炎組織中免疫熒光表達(dá)的代表性圖片(n=5)，藍(lán)色是細(xì)胞核(DAPI)，紅色是H2A，綠色的是F4/80，標(biāo)尺為100 μm。

2.4RA患者滑膜組織中PAD4和CH3表達(dá)明顯增多 利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)參與調(diào)節(jié)METs形成的PAD4和METs主要成分CH3的表達(dá)。與對(duì)照組相比，RA滑膜組織中PAD4和CH3表達(dá)水平均明顯升高(0.82±0.018 vs 0.20±0.015，t=26.43，P<0.001；0.83±0.013 vs 0.40±0.012，t=24.91，P<0.001)。見(jiàn)圖4。

圖4 WB檢測(cè)PAD4與CH3在正?；づc滑膜炎組織中蛋白質(zhì)表達(dá)量變化

3 討論

RA是以慢性滑膜增生和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的全身性自身免疫病，早期的診斷和治療對(duì)RA患者意義重大，尋找RA的新發(fā)病機(jī)制，將為RA的治療提供新的思路和方向[8]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫中的重要組成部分，METs作為一種新型的巨噬細(xì)胞形態(tài)也越來(lái)越受到大家的重視。METs的組成成分及結(jié)構(gòu)與NETs類似，能夠固定和殺死部分病原微生物，參與多種自身免疫病及炎性疾病的病理過(guò)程[9]。巨噬細(xì)胞作為滑膜的重要組成成分之一，滑膜METs在RA中的表達(dá)及其與RA發(fā)病的關(guān)系目前尚未可知。

本研究收集RA及創(chuàng)傷患者的滑膜組織，檢測(cè)其中巨噬細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞極化和METs的水平，結(jié)果顯示RA患者滑膜巨噬細(xì)胞明顯增多，且以促炎的M1型巨噬細(xì)胞為主。PAD是催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的關(guān)鍵酶，而瓜氨酸化抗原可能是RA發(fā)病的始作俑者。研究發(fā)現(xiàn)PAD4參與METs的形成，Mohanan等[10]發(fā)現(xiàn)PAD4能通過(guò)組蛋白脫亞胺作用參與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)介導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞METs形成過(guò)程。本研究通過(guò)免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡法證明RA患者滑膜METs形成顯著升高，PAD4和CH3較對(duì)照組明顯增多。導(dǎo)致METs增多的因素很多，研究發(fā)現(xiàn)次氯酸(hypochlorous acid，HOCL)、活性氧、干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、TNF以及微生物如白念珠菌、馬氏分枝桿菌、金黃色葡萄球菌等均可刺激巨噬細(xì)胞形成METs[11]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可以先向M1型極化，然后在炎性物質(zhì)的刺激性下形成METs。不同表型的巨噬細(xì)胞形成METs的能力有差異，Rayner等[13]發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞較M2型巨噬細(xì)胞更易形成METs。感染是RA發(fā)病的誘因之一，RA滑膜中存在多種慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，體內(nèi)TNF-α、白介素17(interleukin 17，IL-17)、IL-22等炎癥因子明顯升高[14]，巨噬細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是RA滑膜中最豐富的細(xì)胞類型，滑膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子可激活FLSs，活化的FLSs明顯增加巨噬細(xì)胞集落刺激因子及其他炎癥因子的產(chǎn)生，促成巨噬細(xì)胞極化和激活[15]，導(dǎo)致METs形成增多，滑膜巨噬細(xì)胞和FLSs的相互作用促進(jìn)和放大這兩種細(xì)胞的致炎效應(yīng)，導(dǎo)致軟骨降解和骨質(zhì)破壞，在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮核心作用。

不同組織來(lái)源的巨噬細(xì)胞形成METs的能力也不同，如他汀類降膽固醇藥物可增強(qiáng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞系或小鼠腹腔巨噬細(xì)胞METs的形成，但人單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞尚未發(fā)現(xiàn)類似的功能[16]。由于滑膜是RA患者重點(diǎn)累及器官，本研究側(cè)重于RA滑膜METs的形成，后續(xù)也將進(jìn)一步探討其他組織如外周血中METs的形成及作用。

本研究也存在一些局限性。受取材的限制，入組的患者數(shù)量較少，仍需要更大樣本量進(jìn)行研究。另外滑膜METs怎樣參與RA發(fā)病，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索和發(fā)現(xiàn)。