胡金偉，王稀，李曉琴，沈暉，伍勇(長沙市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，長沙 410005)

艾滋病又稱為獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，機(jī)體免疫功能遭到破壞，免疫力下降后會(huì)引起多種機(jī)會(huì)性感染發(fā)生，肺孢子菌肺炎(pneumocystis pneumonia，PCP)是常見的感染性疾病之一。AIDS合并PCP病情發(fā)展迅速，病死率高，因而早期診斷與合理治療十分重要。宏基因二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)通過對(duì)臨床樣本中微生物和宿主核酸的測(cè)序分析，可以無偏倚地檢測(cè)多種病原體，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法的不足，在感染性疾病的診斷中顯示出巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值，已被多個(gè)指南和共識(shí)推薦[1]。本文回顧性分析長沙市第一醫(yī)院利用mNGS輔助診斷1例AIDS合并PCP的情況，報(bào)道如下。

1 病歷資料

1.1入院情況 患者男，39歲，因“咳嗽、氣促半年余，加重1月”于2021年1月11日入長沙市第一醫(yī)院治療?；颊甙肽昵盁o明顯誘因出現(xiàn)陣發(fā)性咳嗽，無明顯咳痰，伴氣促不適，活動(dòng)后明顯，休息可稍緩解?；颊哂谕庠河枰钥垢腥?具體不詳)治療1周，癥狀未見緩解。入院體格檢查：體溫36.5 ℃(腋溫)，心率95次/分鐘，呼吸頻率21次/分鐘，血壓118/66 mmHg，神清，慢性病容。兩側(cè)胸廓對(duì)稱，雙側(cè)呼吸運(yùn)動(dòng)正常，語顫正常，雙肺叩診音清，雙肺呼吸音低，雙肺可聞及少量濕性啰音，無胸膜摩擦音。心律齊，未聞及心臟雜音。雙下肢無水腫。入院前1月8日門診檢查：肺部CT提示兩肺間質(zhì)性肺炎。

1.2入院檢查

1.2.1常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查 白細(xì)胞數(shù)2.11×109/L，淋巴細(xì)胞數(shù)0.68×109/L，血小板76×109/L，血紅蛋白96 g/L，降鈣素原 0.219 ng/mL，C反應(yīng)蛋白8.88 mg/L，紅細(xì)胞沉降率124 mm/h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)13個(gè)/μL，CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)382個(gè)/μL，CD4+/CD8+為0.03；HIV核酸載量334 000 拷貝/mL，結(jié)核抗體、肺炎支原體抗體、抗核抗體、結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)、血培養(yǎng)均陰性。乳酸脫氫酶263 U/L；EB病毒DNA載量7.26×103拷貝/mL。1月13日，1，3-β-D-葡聚糖(G試驗(yàn)，丹娜生物公司試劑)>488.96 pg/mL，陽性。半乳甘露聚糖(GM試驗(yàn)，丹娜生物公司試劑)陰性。

1.2.2mNGS測(cè)序 1月20日患者肺泡灌洗液送至長沙市第一醫(yī)院與華大基因共建的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行宏基因二代測(cè)序檢測(cè)，儀器采用華大基因高通量臺(tái)式測(cè)序系統(tǒng)BGISEQ-50，具備先進(jìn)的聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)和DNA納米球核心測(cè)序技術(shù)。其結(jié)果提示耶氏肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii)序列20 961條(見圖1)，未查見其他細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒。

圖1 mNGS檢測(cè)獲得的耶氏肺孢子菌序列的離散度

1.2.3輔助性CT檢查 1月13日入院再行CT檢查，提示兩肺間質(zhì)性肺炎，PCP可能性大。

1.3入院診斷 1月12日，該患者血樣經(jīng)ELISA初篩及送檢省疾控中心采用蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)(WB)確證HIV-1抗體陽性。AIDS的診斷及AIDS合并PCP診斷參照中國艾滋病診療指南(2018版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。1月13日，結(jié)合病史及各項(xiàng)檢查進(jìn)行入院診斷，(1)肺部感染性病變：患者有咳嗽氣促，肺部CT提示雙肺彌漫性病變，考慮PCP？肺炎？也需警惕結(jié)核感染的可能。(2)人類免疫缺陷綜合征。

1.4診療經(jīng)過 入院后予以拉氧頭孢鈉抗感染，同時(shí)硫酸沙丁胺醇舒張支氣管、多索茶堿解痙平喘、溴己新及痰熱清膠囊止咳祛痰及氧療等對(duì)癥支持治療，病情輕度好轉(zhuǎn)，根據(jù)入院后HIV抗體初篩陽性、G試驗(yàn)陽性、CT結(jié)果提示肺間質(zhì)性肺炎等各項(xiàng)陽性指標(biāo)，完善支纖鏡檢查，抽取肺泡灌洗液明確病原學(xué)診斷。肺泡灌洗液送本院聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室mNGS檢測(cè)出非典型病原體耶氏肺孢子菌，進(jìn)而患者艾滋病合并PCP診斷明確。通過改善治療方案，予以哌拉西林/他唑巴坦抗細(xì)菌，復(fù)方磺胺甲噁唑抗PCP，激素抗炎等對(duì)癥支持治療，并啟動(dòng)ART治療后癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

經(jīng)治療后實(shí)驗(yàn)室結(jié)果提示淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均有不同程度升高，其中CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)124個(gè)/μL，CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)1 305個(gè)/μL，CD4+/CD8+為0.10；HIV核酸載量大幅度下降，為1 430拷貝/mL；1,3-β-D-葡聚糖(G試驗(yàn))64.29 pg/mL，小于參考值70 pg/mL，由陽性轉(zhuǎn)為陰性。白細(xì)胞計(jì)數(shù)6.71×109/L,降鈣素原、乳酸脫氫酶結(jié)果正常。CT檢查：兩肺片狀、斑片狀磨玻璃影較前吸收好轉(zhuǎn)，網(wǎng)格樣改變亦見好轉(zhuǎn)，左下肺外基底段團(tuán)片狀密影進(jìn)一步吸收縮小。

患者于2月24號(hào)病情好轉(zhuǎn)出院。出院3個(gè)月后隨訪，患者無發(fā)熱、氣促等不適，生活完全自理。

2 討論

長久以來，PCP診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是通過多種染色技術(shù)直接鏡檢，在肺組織或下呼吸道分泌物中發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子菌的包囊或滋養(yǎng)體，作為確診的依據(jù)。常用的檢測(cè)方法有吉姆薩染色、六胺銀染色和免疫熒光染色，其中六胺銀染色最為常用，但容易受操作者染色技術(shù)、標(biāo)本采集因素以及閱片者的經(jīng)驗(yàn)影響，其檢出率往往偏低。熒光染色法快速方便，其靈敏度高，但發(fā)現(xiàn)其假陽性率很高。PCR方法與傳統(tǒng)染色法和熒光法比較敏感性高和操作簡便，檢測(cè)的標(biāo)本可為肺泡灌洗液、呼吸道分泌物、外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清等，但PCR法受引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件、人員操作等環(huán)節(jié)的影響，易造成假陽性。本實(shí)驗(yàn)室六胺銀染色未作為常規(guī)開展項(xiàng)目，常根據(jù)醫(yī)生提出的要求再行實(shí)驗(yàn)性檢測(cè)，該患者肺泡灌洗液直接送檢mNGS。

mNGS作為新興的病原學(xué)基因檢測(cè)診斷技術(shù)，用于診斷PCP具有準(zhǔn)確快速的特點(diǎn),能避免呼吸道定植的干擾，還可以檢出合并的其他病毒或細(xì)菌感染,較PCP的其他病原學(xué)診斷方法更具優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)免疫抑制合并肺部感染患者的診斷有重要的指導(dǎo)意義[2]。本醫(yī)院聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室能獨(dú)立開展病原體mNGS檢測(cè)，使用肺泡灌洗液450 μL即可，其結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析比對(duì)快速檢測(cè)出耶氏肺孢子菌，未查見其他細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒等，具有極高靈敏度和特異性。Wang等[3]對(duì)108例免疫抑制患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行mNGS 檢測(cè)，該技術(shù)顯示出良好的診斷潛力，不受免疫抑制程度的影響，指導(dǎo)抗菌藥物治療的成功率顯著高于經(jīng)驗(yàn)用藥組。

本病例中患者臨床表現(xiàn)、G試驗(yàn)陽性、CT提示肺間質(zhì)性肺炎等符合艾滋病合并PCP的診斷。通過送檢患者肺泡灌洗液做mNGS而檢出耶氏肺孢子菌，明確感染病原菌，從而最終診斷為AIDS合并PCP。臨床醫(yī)生明確該診斷后使用藥物治療后患者病情好轉(zhuǎn)，達(dá)到治療轉(zhuǎn)歸。病原體宏基因檢測(cè)可對(duì)于重癥患者、免疫功能缺陷患者、腫瘤患者、不明原因感染患者等作出有效的早期檢測(cè)，有助于醫(yī)生快速診斷疾病。隨著mNGS技術(shù)的不斷完善，其有望在近些年成為感染性疾病病原學(xué)診斷的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。