陳明心，王煒，張岱，任偉宏(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州450000)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作為傳染病項目，其時效性決定臨床輸血、內(nèi)鏡、手術(shù)等能否及時開展[1]。傳統(tǒng)的ELISA需2 h[2]，化學(xué)發(fā)光法也需30 min以上[3]。目前HBsAg快速檢測主要運用膠體金法，該方法受主觀因素影響大，弱陽性樣本漏檢率高[4]。因此，需要尋找新的快速檢測方法。

連續(xù)監(jiān)測法多用于生化檢驗領(lǐng)域[5-6]，其特點是無需等到反應(yīng)終點，不斷監(jiān)測反應(yīng)過程，找出合適分析點。連續(xù)監(jiān)測法快速、準確。目前免疫檢測多需“洗板”[7-8]，該步驟中斷了免疫反應(yīng)過程，因此，連續(xù)監(jiān)測法未能在免疫檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用。

均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是一種以表面包被有親和涂層的受體微球和供體微球為載體的均相免疫學(xué)檢測技術(shù)[9-10]，2種微球各自包被雙抗體夾心法中的一種抗體，當反應(yīng)體系中抗原抗體相互結(jié)合時，2種微球距離拉近，單線態(tài)氧可從供體微球傳遞到受體微球，并轉(zhuǎn)化為光信號，否則，單線態(tài)氧無法有效傳遞，光信號缺失，通過該方法來區(qū)分結(jié)合相和未結(jié)合相，無需“洗板”，實現(xiàn)液體和液體的均相反應(yīng)。本次研究嘗試在均相反應(yīng)體系中應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測法分析抗原抗體反應(yīng)以縮短檢測過程，提高臨床診療效率。

1 材料和方法

1.1儀器與試劑 LiCA500、LiCA800光激化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀(北京科美公司)。LiCA配套HBsAg檢測試劑，包含試劑A、試劑B以及LiCA檢測系統(tǒng)共用通用液(北京科美公司)；質(zhì)控品(0.2 IU/mL，北京康徹思坦公司)；校準品(0.05 IU/mL，北京科美公司)。

1.2方法

1.2.1商品化檢測程序(方案1)選取樣本 按照試劑盒說明書進行。取樣本、試劑A、試劑B各25 μL進行混合，37 ℃溫育反應(yīng)17 min(溫育1)后，加入175 μL通用液再37 ℃溫育反應(yīng)15 min(溫育2)，其cut off值為0.05 IU/mL，即按照該程序所得結(jié)果大于0.05 IU/mL時判斷為陽性。

選取該方法檢測HBsAg陽性樣本128份，無明顯溶血、脂血和膽紅素血。其中，87例為0.05～0.5 IU/mL范圍內(nèi)的弱陽性樣本，陰性樣本157例。

1.2.2確定連續(xù)監(jiān)測法檢測程序(方案2) (1)確定“溫育1”反應(yīng)時間。取3例陽性樣本(濃度范圍0.05～0.4 IU/mL)、0.05 IU/mL的校準品和5例陰性樣本，將“溫育2”穩(wěn)定在15 min，控制“溫育1”時間分別為17 min、15 min、13 min、11 min、9 min、7 min、5 min，陽性、陰性樣本均只檢測1次，0.05 IU/mL的校準品重復(fù)5次，計算均值和標準差，5例陰性樣本共同計算均值和標準差，找出陽性樣本與陰性樣本能夠顯著區(qū)分的最短時間點。

(2)確定“溫育2”反應(yīng)時間。取3例陽性樣本(濃度范圍0.05～0.4 IU/mL)、0.05 IU/mL校準品和5例陰性樣本，采用確定的“溫育1”反應(yīng)時間，控制“溫育2”時間分別為0 min、2 min、4 min、6 min，陽性、陰性樣本均只檢測1次，0.05 IU/mL校準品重復(fù)5次，計算均值和標準差，找出陽性樣本與陰性樣本能夠顯著區(qū)分的最短時間點。

(3)形成連續(xù)讀數(shù)檢測程序(方案2)。按照上述確定的“溫育1”和“溫育2”時間，反應(yīng)完成后每間隔1 min讀數(shù)1次，連續(xù)讀數(shù)3次。

1.2.3歸一化處理 將1.2.1中選取的樣本按照方案2隨機選取9 d進行檢測，每次試驗同時檢測0.05 IU/mL校準品。然后分別將3次讀數(shù)做 “歸一化”處理。歸一化處理方式如下：第1次讀數(shù)歸一化結(jié)果=樣本第1次讀數(shù)÷當次校準品第1次讀數(shù)，第2次讀數(shù)歸一化結(jié)果=樣本第2次讀數(shù)÷當次校準品第2次讀數(shù)，第3次讀數(shù)歸一化結(jié)果=樣本第3次讀數(shù)÷當次校準品第3次讀數(shù)。

1.2.4將連續(xù)變量轉(zhuǎn)化為分類變量

1.2.4.1單次讀數(shù)轉(zhuǎn)化為分類變量 選取27例低值樣本(方案1中檢測結(jié)果為0.05～0.1 IU/mL)和22例高值樣本(方案2檢測第1次讀數(shù)大于0.8 IU/mL)，在SPSS 24.0中，在“轉(zhuǎn)換”菜單下選擇“最優(yōu)分箱”，以“方案1”確定的陰陽性結(jié)果作為“金標準”，對3次讀數(shù)歸一化結(jié)果分別進行最優(yōu)化分區(qū)段，找出每次讀數(shù)的最佳分界點。將該分界點作為可疑分界點，將每次讀數(shù)劃分為3個分類變量：小于可疑分界點設(shè)定為“c”，介于可疑分界點與1之間設(shè)定為“b”，大于1設(shè)定為“a”。由此，單次讀數(shù)結(jié)果可轉(zhuǎn)化為“a”、“b”、“c”其中一種。

1.2.4.23次讀數(shù)轉(zhuǎn)化為綜合分類變量 3次讀數(shù)進行隨機排列組合可形成以下10種組合分類變量：“3a”、“2a1b”、“1a2b”、“3b”、“2b1c”、“1b2c”、“3c”、“2a1c”、“1a2c”、“1a1b1c”。由此，3次讀數(shù)結(jié)果可轉(zhuǎn)化為以上其中一種。

1.2.5分類回歸樹(classification and regressim tree, CART)制定判斷規(guī)則并進行符合率驗證

1.2.5.1確定陰陽性判斷規(guī)則并進行符合率驗證 按照“方案2”所得的結(jié)果，將128例陽性樣本和157例陰性樣本分別標記為1.2.4.2中相應(yīng)的組合分類變量，然后將“方案1”確定陰陽性結(jié)果作為“金標準”，在SPSS 24.0中做CART決策樹，隨機選取70%樣本確定判斷規(guī)則，30%樣本進行驗證，并各自進行風(fēng)險估算。風(fēng)險估算指數(shù)應(yīng)在0.05以內(nèi)，驗證樣本的陰性符合率和陽性符合率應(yīng)各自達到80%以上。

1.2.5.2確定“可疑”判斷規(guī)則 確定“金標準”在各組合分類變量中陰性和陽性的例數(shù)，找出陰性樣本和陽性樣本重疊最多的組合分類變量，標記為這些分類變量的樣本視作可疑樣本，確定為可疑樣本的應(yīng)按“方案1”進行復(fù)測。

1.2.6檢出限驗證 廠商聲明的檢出限為0.2 IU/mL，根據(jù)CNAS-GL038《臨床免疫學(xué)定性檢驗程序性能驗證指南》，采用0.2 IU/mL康徹思坦質(zhì)控品，并同時稀釋配制出0.1 IU/mL濃度，以這2個濃度的樣本每天按照確定的連續(xù)讀數(shù)方案做4次測試，共做5 d。每個濃度樣本要求至少有19次測試結(jié)果按照1.2.5中制定的規(guī)則判斷為陽性或可疑為符合要求。至少應(yīng)符合廠商聲明的0.2 IU/mL的檢出限要求。

1.2.7陰性復(fù)檢率比較 比較“金標準”判定為陰性的樣本在3次連續(xù)讀數(shù)綜合和第1次讀數(shù)2種方案中判斷為“可疑”樣本的比例。3次連續(xù)讀數(shù)遵循上述制定的可疑判斷規(guī)則，第1次讀數(shù)進行分類變量轉(zhuǎn)化后，標記為“b”的樣本判斷為可疑。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 24.0軟件進行卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1確定反應(yīng)時間 當“溫育1”為9、11、13、15、17 min時，“溫育2”為4、6 min時，陽性樣本和陰性樣本有明顯區(qū)分，且陽性樣本檢測值均大于cut off值(0.05 IU/mL)。見圖1。故確定方案2反應(yīng)程序：“溫育1”反應(yīng)9 min，“溫育2”反應(yīng)4 min，反應(yīng)結(jié)束后開始讀數(shù)，之后每隔1 min讀數(shù)1次，一共完成3次讀數(shù)，總反應(yīng)時間為15 min。

注：A,確定“溫育1”時間；B,確定“溫育2”時間。

2.2單次讀數(shù)最優(yōu)分箱結(jié)果分析 第1次讀數(shù)有6例陰性樣本大于0.86，所有陽性樣本均大于0.86，可疑分界點定為0.86；第2次讀數(shù)有1例陽性樣本小于0.87，所有陰性樣本均小于0.87，可疑分界點定為0.87；第3次讀數(shù)有1例陽性樣本小于0.89，有7例陰性樣本大于0.89，可疑分界點定為0.89。

2.3CART決策樹結(jié)果 (1)CART決策樹訓(xùn)練數(shù)據(jù)分析結(jié)果及驗證結(jié)果見圖2，基尼指數(shù)為0.457，“3c”和“1b2c”歸為陰性，“3a”、“2a1b”、“1a2b”、“3b”和“2b1c”歸為陽性，對于訓(xùn)練樣本的風(fēng)險估算指數(shù)為0.02，對于驗證樣本的風(fēng)險估算指數(shù)為0.011，均小于0.05，可以達到低風(fēng)險的要求。驗證樣本的陰性符合率為100%，陽性符合率為97.5%，均大于95%，符合WS/T 494—2017《臨床定性免疫檢驗重要常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》要求。

注：A，訓(xùn)練樣本分析結(jié)果；B，驗證樣本檢驗結(jié)果。

(2)落入不同組合分類變量中“金標準”的陰性和陽性結(jié)果，“3b”和“2b1c”模式陰、陽性出現(xiàn)了重疊，分別為：“3b”，陰性2例，陽性9例；“2b1c”，陰、陽性各3例。其余分類變量未出現(xiàn)重疊。“2a1c”、“1a2c”、“1a1b1c”沒有標本落到該分類中(將此類歸為可疑)。

(3)由上得出判斷規(guī)則：陽性，“3a”、“2a1b”、“1a2b”；可疑，“3b”、“2b1c”、“2a1c”、“1a2c”、“1a1b1c”；陰性，“3c”、“1b2c”。

2.4檢出限驗證 0.2 IU/mL的康徹思坦質(zhì)控品5 d檢測20次，均為“3a”分類模式,判斷為陽性。稀釋到0.1 IU/mL時，有8次為“3a”模式，7次為“2a1b”模式、2次為“1a2b”模式，共17次判斷為陽性；2次為“2a1c”模式，1次為“3b”模式，共3次為可疑。0.1 IU/mL時，復(fù)檢數(shù)會增加，但不會出現(xiàn)漏檢，檢出限驗證達到要求。

2.5陰性復(fù)檢率 第1次讀數(shù)判斷方案的陰性復(fù)檢率為7.64%(12/157)，3次連續(xù)讀數(shù)判斷方案的陰性復(fù)檢率為2.55%(4/157)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.215，P=0.04)。

3 討論

HBsAg檢測速度達不到需求，將導(dǎo)致臨床診療效率大大下降，醫(yī)患糾紛也相應(yīng)增加。同時在實踐工作中，臨床大多數(shù)僅關(guān)注定性結(jié)果。鑒于以上實際需求，一種提高臨床效率的策略是，先保證大多數(shù)人關(guān)注的定性以及快速檢測問題。而對于少部分需要觀察療效的患者往往對快速檢測要求不高，可以通過對目前現(xiàn)有的商業(yè)化檢測流程進行優(yōu)化而解決。

通過對反應(yīng)時間的摸索將反應(yīng)時間從32 min降低到15 min。對于HBsAg這類對于靈敏度要求較高的傳染病項目，快速檢測可能會導(dǎo)致弱陽性樣本出現(xiàn)漏檢。試驗設(shè)置有臨界校準品，經(jīng)過歸一化處理后，樣本檢測結(jié)果大于“1”判為陽性，小于“1”判為陰性。然而，縮短反應(yīng)時間后，靠近cut off值附近的陽性樣本(0.05～0.15 IU/mL)會出現(xiàn)部分檢測結(jié)果也小于“1”。有學(xué)者針對該現(xiàn)象采取了雙診斷點，即除了“1”的陰陽性判斷點，再增加一個可疑分界點[11]。本次實驗通過SPSS最優(yōu)分箱確定每次讀數(shù)可疑分界點。

在數(shù)據(jù)驗證中本研究設(shè)置了可疑判斷規(guī)則，然而連續(xù)讀數(shù)法會得到多組數(shù)據(jù)，這和單次讀數(shù)設(shè)置可疑規(guī)則的方式仍有不同，需要采用相應(yīng)的挖掘算法。CART根據(jù)數(shù)據(jù)集的不同屬性對一堆無序無規(guī)則的數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練學(xué)習(xí)，從而訓(xùn)練出一個較為準確的分類模型[12]，該算法輸出結(jié)果較為直觀，容易理解[13]，已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[14-15]。目前已有通過CART建立陰陽定性診斷模型建立的研究[16]。本次研究嘗試采用該算法建立多組數(shù)據(jù)分析方法，首先將上述3次讀數(shù)各自轉(zhuǎn)化的分類變量進行隨機組合，形成10種組合分類變量，然后通過CART決策樹對這10種組合分類變量進行訓(xùn)練，并抽取30%樣本進行驗證，結(jié)果符合率達到要求。然后找出陰陽性樣本重疊區(qū)域主要出現(xiàn)在哪個分類變量，從而確定3次讀數(shù)可疑判斷規(guī)則。檢出限驗證中0.1 IU/mL樣本20次檢測數(shù)據(jù)均不會出現(xiàn)漏檢，但是有3次需要進行復(fù)檢，0.2 IU/mL樣本20次數(shù)據(jù)均可直接判定為陽性，不需復(fù)檢，符合廠商聲稱的0.2 IU/mL檢出限的要求。

為達到快速檢測目的，還應(yīng)盡可能減少復(fù)檢率。由于臨床中陰性樣本出現(xiàn)概率很高，而低值弱陽性樣本出現(xiàn)概率較低，且弱陽性樣本應(yīng)常規(guī)復(fù)檢，因此對臨床檢測周轉(zhuǎn)時間(turnaround time, TAT)有影響的主要是陰性樣本復(fù)檢率。實驗結(jié)果表明，連續(xù)監(jiān)測多數(shù)據(jù)分析模式的陰性復(fù)檢率為2.55%，和縮短時間后只進行1次讀數(shù)結(jié)果相比，陰性復(fù)檢率下降，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可看出，多次讀數(shù)可有效減少隨機誤差波動帶來的陰性復(fù)檢率提高而拖累TAT的問題。

本研究初步嘗試了采用多點讀數(shù)結(jié)合CART決策樹數(shù)據(jù)挖掘算法，建立一種快速連續(xù)讀數(shù)檢測方案，在保證準確的前提下，實現(xiàn)了免疫定性快速檢測。