孫士佳，宋為娟(.南京梅山醫(yī)院檢驗科，南京 20039； 2.江蘇省人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部，南京 20029； 3.國家醫(yī)學(xué)檢驗臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，南京 20029)

鐮刀菌又稱鐮孢霉屬，常由外傷感染引起人類角膜炎癥、眼內(nèi)炎、足菌腫以及甲板、黏膜、皮膚和皮下組織感染，免疫力下降時可引起腦、心、肺等深部感染，甚至真菌血癥[1]。層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)是鐮刀菌屬主要致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，屬于條件致病菌，免疫力正常的成人并不多見。因此，臨床上鐮刀菌感染往往很容易被忽視，且相關(guān)文獻報道該菌導(dǎo)致的血流感染較少。2021年11月，我院從1例爆炸傷患者血液中分離出1例層生鐮刀菌，現(xiàn)報道如下。

1 病歷資料

患者男，28歲，于2021年10月24日因金屬粉塵及含氟樹脂材料爆炸致全身多處燒傷，約30 min后由救護車就近醫(yī)院救治，診斷為“爆燃傷”，予以氣管插管、補液等措施后送至南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診搶救室。患者體溫33.6 ℃，脈搏未觸及，呼吸26次/分鐘，血壓70/56 mmHg。雙側(cè)瞳孔等大、等圓，左1 mm，右1 mm，雙側(cè)對光反射消失。頭面頸、雙上肢、胸背部、會陰部、臀部、雙下肢可見約93%總體表面積(total body surface area，TBSA)Ⅱ-Ⅲ度燒傷，以Ⅲ度為主，行全身CT檢查后送手術(shù)室行急診焦痂切開減張術(shù)，術(shù)后轉(zhuǎn)急診重癥監(jiān)護室進一步治療。

多學(xué)科專家會診中指出患者特重度燒傷明確，創(chuàng)傷面積為95%，其中Ⅲ度達90%，屬致命傷。早期以抗休克為主，注意晶體、膠體比例及補液量，后期以抗感染為主，尤其血流感染?；颊呷朐寒斕煜扔枰詠啺放嗄?西司他丁和萬古霉素強化抗感染經(jīng)驗治療，后根據(jù)醫(yī)院燒傷患者耐藥譜改用頭孢哌酮/舒巴坦加替加環(huán)素聯(lián)合抗感染，入院后5 d內(nèi)，痰、血、分泌物培養(yǎng)等未見異常，10月29日血清真菌1,3-β-D-葡聚糖檢測(G試驗,北京金山川公司試劑，光度法)和曲霉半乳糖甘露聚糖抗原檢測(GM試驗,美國Bio-Rad公司試劑，ELISA法)結(jié)果開始異常升高。入院第7天開始，痰、傷口分泌物標本陸續(xù)培養(yǎng)出嗜麥芽窄食單胞菌和陰溝腸桿菌，實驗室檢查：降鈣素原(PCT) 8.44 ng/mL，WBC 23.51×109/L，肌鈣蛋白T(TnT) 1 799 ng/L，肌鈣蛋白Ⅰ(TnⅠ)陽性，血清肌紅蛋白(SMb)238.2 ng/mL。根據(jù)體外藥敏結(jié)果，停用頭孢哌酮/舒巴坦及替加環(huán)素，予以頭孢他啶/阿維巴坦聯(lián)合氨曲南抗感染治療。入院第11天，2021年11月4日血培養(yǎng)需氧瓶培養(yǎng)4 d 16 h報陽，直接涂片革蘭染色鏡檢提示絲狀真菌陽性。臨床接絲狀真菌報陽后，于11月4日予以兩性霉素B聯(lián)合泊沙康唑抗真菌治療，用藥后血清真菌G試驗結(jié)果逐漸轉(zhuǎn)陰，GM試驗結(jié)果逐漸下降，用藥前后G試驗和GM試驗結(jié)果見圖1、圖2。后續(xù)血液培養(yǎng)結(jié)果轉(zhuǎn)陰。11月26日，患者循環(huán)在持續(xù)輸液、補液的情況下仍無法維持，當日下午患者臨床死亡。

圖1 用藥前后G試驗結(jié)果

圖2 用藥前后GM試驗結(jié)果

2 微生物學(xué)檢查及結(jié)果

2.1血培養(yǎng)結(jié)果及真菌形態(tài) 無菌采集中心靜脈、導(dǎo)管各一套血培養(yǎng)標本，置于BD公司BACTEC FX全自動培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)，4 d 16 h后中心靜脈側(cè)需氧瓶陽性報警，抽取陽性瓶培養(yǎng)液涂片革蘭染色，鏡檢可見有隔真菌菌絲及鐮刀形分生孢子(圖3A)，陽性培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種血瓊脂平板和沙氏平板，于26 ℃溫箱中培養(yǎng)，48 h后見培養(yǎng)基上氣生菌絲呈棉絮狀蔓延;72 h后菌落生長迅速，菌落中央有一定程度的束狀趨勢(圖3B);5 d后氣生菌絲豐富疏松，中央氣生菌絲黏合呈束狀，高0.2～0.8 cm，羊毛狀，呈白色，背面較正面色深，呈淡黃色或棕黃色(見圖3C、3D、3E)。采用透明膠帶法進行棉蘭染色，鏡檢可見菌絲和分生孢子，大分生孢子少而細長，多分隔，呈鐮刀形；小分子孢子橢圓形至梨形，截平，無厚壁孢子(圖3F)。

注：A，陽性培養(yǎng)液革蘭染色(×1 000)；B，72 h沙氏平板菌落形態(tài)；C、D、E，5 d后血平板、沙氏平板正面、沙氏平板背面菌落形態(tài)；F，棉蘭染色鏡下形態(tài)(×400)。

2.2菌種鑒定

2.2.1鏡檢 結(jié)合不同培養(yǎng)條件下的菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)，初步考慮鐮刀菌屬。

2.2.2質(zhì)譜鑒定 使用甲酸-乙腈超聲裂解法對菌株進行前處理，取處理后上清液通過法國生物梅里埃公司Vitek MS質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果為Fusariumproliferatum(層生鐮刀菌)，置信度99.99%(圖4)。

圖4 層生鐮刀菌質(zhì)譜鑒定圖譜

2.2.3分子生物學(xué)鑒定 使用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進行基因測序鑒定，引物序列：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由南京擎科生物有限公司完成引物合成和基因測序。擴增產(chǎn)物大小為500～700 bp，采用ABI 3730測序儀進行雙向基因測序。測序結(jié)果上傳GenBank，經(jīng)BLAST比對，與層生鐮刀菌株EB0732Z6，GenBank登錄號 MT372093.1，同源性99.46%，且比對得分最高(1 011)。

2.3藥敏結(jié)果 依據(jù)美國臨床和實驗室標準化委員會(CLSI)關(guān)于產(chǎn)孢絲狀真菌的液體培養(yǎng)基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案M38-A2方案標準，使用Yeast One YO10型真菌藥敏96孔板進行藥敏試驗，MIC藥敏結(jié)果如下：兩性霉素B(AMB)：1 μg/mL(S)，伊曲康唑(ITR)：1 μg/mL(S)，泊沙康唑(POS)：0.5 μg/mL(S)，伏立康唑(VOR)：1 μg/mL(S)。

3 討論

鐮刀菌是一種在自然界分布廣泛的有絲分裂孢子真菌，種類繁多[2]，屬于條件致病菌。自1963年我國首次報告鐮刀菌致病以來，鐮刀菌侵襲性感染尤其在免疫缺陷和免疫抑制患者中的報道逐年增多[3-4]，其發(fā)病率和病死率僅次于白念珠菌和曲霉感染[5]，及時診斷、有效治療以及提高患者免疫力是提高侵襲性鐮刀菌感染患者生存率的關(guān)鍵。

鐮刀菌在體內(nèi)具有游離孢子，促進其在血液中傳播與生長，侵襲性鐮刀菌病血液培養(yǎng)多呈陽性[6]。目前沒有商品化試劑盒可用于感染人群鐮刀菌種屬特異性抗原檢測。鐮刀菌可釋放一種游離抗原，與曲霉菌半乳糖甘露聚糖抗原有交叉反應(yīng)。研究采用伯樂PlateliaTM曲霉菌抗原檢測試劑盒，檢測11例明確排除曲霉菌感染的播散性鐮刀菌感染患者血清標本，其中9例反復(fù)出現(xiàn)陽性[7]。因此，在播散性鐮刀菌流行區(qū)域，GM試驗陽性可作為侵襲性鐮刀菌病的輔助診斷指標之一[8]。1,3-β-D-葡聚糖是真菌細胞壁上的一種重要多糖，可在鐮刀菌引起的菌血癥和肺炎患者血液中檢測到[9]，但其缺乏特異性[10]。

本例患者因爆燃傷致全身90%以上的Ⅲ度燒傷，導(dǎo)致表皮的大面積破壞以及體液和細胞免疫紊亂，血液培養(yǎng)分離出層生鐮刀菌，根據(jù)歐洲癌癥治療研究組/真菌研究組教育和研究共同體(EORTC/MSGERC)有關(guān)侵襲性真菌病的定義，可明確診斷為侵襲性鐮刀菌感染[11]。因真菌種類及培養(yǎng)方法的不同，其生長時間存在差異。真菌生長速度較慢，患者入院后的強效抗感染藥物的使用以及感染初期血液含菌量少，增殖力弱，使得患者在入院11 d后，血液培養(yǎng)4 d才出現(xiàn)培養(yǎng)陽性結(jié)果。

免疫缺陷患者鐮刀菌感染具有侵襲性和播散性[12]，常出現(xiàn)典型皮疹和持續(xù)性不規(guī)則發(fā)熱癥狀[4,13]。本患者皮膚大面積燒傷，不易發(fā)現(xiàn)鐮刀菌感染的原發(fā)病灶及其引起的典型皮膚病變。嚴重燒傷患者體液丟失過多，有效循環(huán)減少，因此出現(xiàn)低體溫狀態(tài)。此外，鐮刀菌播散性感染還會引起鐮刀菌性肺炎，本例患者兩肺紋理增多，多發(fā)斑片影，疑似肺部感染。

免疫功能低下的侵襲性鐮刀菌病患者需積極抗真菌治療。協(xié)同研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用兩性霉素B和泊沙康唑治療尖孢鐮刀菌感染的小鼠后，其生存期延長，且真菌負荷量降低[14]。本例患者臨床接絲狀真菌報陽后，予以兩性霉素B聯(lián)合泊沙康唑抗真菌治療，用藥后血清真菌G 和GM試驗結(jié)果逐漸轉(zhuǎn)陰，同時后續(xù)血培養(yǎng)結(jié)果轉(zhuǎn)陰。鐮刀菌種類繁多，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法無法做出準確鑒定，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、基因測序等方法可準確快速進行菌種鑒定，為臨床提供快速、可靠的檢驗結(jié)果。