姜蕾，饒玉婷，葛茹，郭小兵(.濮陽市油田總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河南濮陽 457000；.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，鄭州 45005)

腿傷克斯特菌為革蘭陰性球桿菌，與產(chǎn)堿桿菌屬、博德特菌屬、無色桿菌屬及Pigmentiphaga相近，同屬于產(chǎn)堿菌科[1]。在人體感染中，腿傷克斯特菌是一種極其少見的病原體[2]，傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法和MicroScan WalkAway、Vitek 2、API 20 NE等自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)無法準(zhǔn)確地鑒定出該菌[3]，因此，該菌可能存在漏檢或錯(cuò)檢的現(xiàn)象，使人們可能忽視了該菌的臨床重要性。隨著基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及16S rDNA測序技術(shù)的推廣與應(yīng)用，截至目前，腿傷克斯特菌在各種臨床標(biāo)本中被發(fā)現(xiàn)，但在中國僅有1例相關(guān)報(bào)道[4]。多篇文獻(xiàn)指出腿傷克斯特菌與疾病的發(fā)生有關(guān)[5-7]?，F(xiàn)對其鑒定方法、生物學(xué)特性及藥物敏感性進(jìn)行分析，為腿傷克斯特菌的鑒定和臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2019年1月1日—2020年12月31日濮陽市油田總醫(yī)院呼吸科和心臟內(nèi)科的4位不同患者的合格痰標(biāo)本。合格的標(biāo)準(zhǔn)為：痰涂片鏡下革蘭染色白細(xì)胞>25個(gè)/低倍視野，鱗狀上皮細(xì)胞<10 個(gè)/低倍視野[8]。本實(shí)驗(yàn)室保存的大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌 ATCC 27853為藥敏質(zhì)控菌株。

1.2患者資料 患者1男性，68歲，呼吸一區(qū)，臨床診斷：肺部感染；泌尿道感染；慢性阻塞性肺病伴有急性加重；氣管切開術(shù)后拔管困難；缺血缺氧性腦病后遺癥；陳舊性肋骨骨折；糖尿??；高血壓。其痰培養(yǎng)同時(shí)檢出肺炎克雷伯菌及腿傷克斯特菌。患者2男性，78歲，呼吸一區(qū)，臨床診斷：肺部感染；腦出血術(shù)后；氣管切開術(shù)后拔管困難；陳舊性腦梗死；下肢靜脈血栓形成；高血壓。其痰培養(yǎng)同時(shí)檢出肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌及腿傷克斯特菌?；颊?男性，78歲，呼吸二區(qū)，臨床診斷：肺間質(zhì)纖維化并感染；腦萎縮；混合性睡眠呼吸暫停綜合征；陣發(fā)性心房顫動(dòng)；冠心??；高血壓；糖尿病。其痰培養(yǎng)同時(shí)檢出銅綠假單胞菌及腿傷克斯特菌?；颊?女性，71歲，心臟內(nèi)科監(jiān)護(hù)室，臨床診斷：肺部感染；慢性腎衰竭；腎性貧血；冠心??；高血壓；2型糖尿病伴多個(gè)并發(fā)癥。其痰培養(yǎng)同時(shí)檢出銅綠假單胞菌及腿傷克斯特菌。

1.3主要儀器與試劑 血平板、麥康凱平板、含萬古霉素巧克力平板(鄭州安圖生物公司)；革蘭染液(珠海貝索公司)；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(杭州濱和微生物試劑公司)；MALDI-TOF MS儀及基質(zhì)(德國Bruker公司)；甲酸、乙腈和三氟乙酸(美國Sigma公司)；Mastercy clerpro PCR 儀(德國Eppendorf公司)；2×Taq Master Mix(南京諾唯贊公司)；Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏系統(tǒng)、配套GN鑒定卡及GN-09藥敏卡(法國生物梅里埃公司)。

1.4細(xì)菌培養(yǎng) 取患者痰標(biāo)本涂布于血平板、麥康凱平板及含萬古霉素巧克力平板上，分區(qū)劃線，置 35 ℃培養(yǎng) 24～48 h。

1.5菌種鑒定

1.5.1Vitek 2 Compact鑒定 挑取3個(gè)以上單個(gè)純菌落于3 mL 0.45% NaCl溶液中，調(diào)至菌懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，插入GN卡上機(jī)經(jīng)Vitek 2 Compact系統(tǒng)對細(xì)菌進(jìn)行種類鑒定。

1.5.2MALDI-TOF MS鑒定 用無菌牙簽挑取血平板上單個(gè)純菌落均勻涂布于靶板的靶點(diǎn)上，室溫干燥后，依次加1 μL 70%甲醛及1 μL基質(zhì)溶液，室溫下自然晾干后，將靶板放入MALDI-TOF MS儀器中進(jìn)行分析。分析軟件得出分值，依據(jù)說明書：>2.000，認(rèn)為鑒定到種；1.700～1.999，認(rèn)為鑒定到屬；0～1.699，認(rèn)為此鑒定結(jié)果不可靠。

1.5.316S rDNA測序 采用水煮法(100 ℃煮沸10 min，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心10 min)提取細(xì)菌DNA。16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[9]由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司，使用賽默飛ABI 3730系列高通量基因分析儀進(jìn)行Sanger雙向測序，測序結(jié)果上傳至局部序列比對基本檢索工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)中Nucleotide BLAST進(jìn)行序列比對，確定細(xì)菌種類。

1.6革蘭染色及生化反應(yīng) 用接種環(huán)挑取血平板上單個(gè)菌落于載玻片上，待干燥固定后行革蘭染色。過氧化氫酶試驗(yàn)：用接種環(huán)挑取細(xì)菌于載玻片上，滴1滴3%H2O2，出現(xiàn)大量氣泡為陽性。氧化酶試驗(yàn)：用潔凈濾紙蘸取少量細(xì)菌，滴加試劑1%鹽酸二甲基對苯二胺，濾紙呈深紫色為陽性。其他試驗(yàn)在微量生化反應(yīng)管中進(jìn)行：分別挑取純菌落至反應(yīng)管中，置35 ℃溫育24 h后，依據(jù)試劑說明書分別加入相應(yīng)指示試劑后觀察結(jié)果。

1.7藥物敏感性試驗(yàn) 采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏系統(tǒng)及配套GN-09藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果依據(jù)2021年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100其他非腸桿菌折點(diǎn)判讀[10]。

2 結(jié)果

2.1菌落形態(tài)及鏡下形態(tài) 35 ℃培養(yǎng)24 h 時(shí)，4株菌株在血平板、含萬古霉素巧克力平板及麥康凱平板上均生長良好，血平板、巧克力平板上菌落呈灰白色，麥康凱平板上菌落呈淺紫色，菌落均表面粗糙、扁平且遷徙生長(圖1、圖2)。血平板、麥康凱平板上的菌落用棉拭子蘸取分別呈現(xiàn)黃色及紫色。鏡下形態(tài)為單個(gè)、成對或短鏈狀排列的革蘭陰性球桿菌(圖3)。

圖1 血平板35 ℃培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)

圖2 麥康凱平板35 ℃培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)

圖3 革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

2.2菌種鑒定結(jié)果 4株菌株經(jīng)Vitek 2 Compact鑒定均為放射型根瘤菌(Rzb.radiobacter)，可信度均為99%。MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果均為腿傷克斯特菌(Kerstersiagyiorum)，鑒定分值分別為2.285、2.158、2.130和2.235。16S rDNA測序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對顯示為Kerstersiagyiorum(均>99%的覆蓋度和>99%的一致性)。

2.3主要生化反應(yīng)結(jié)果 4株菌株生化反應(yīng)相同，均過氧化氫酶、動(dòng)力試驗(yàn)陽性，氧化酶、硝酸鹽還原、尿素酶、氨基酸脫羧酶(鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸)、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽利用、糖(醇、苷)類發(fā)酵、β-半乳糖苷酶、七葉苷水解試驗(yàn)均陰性。

2.4藥敏結(jié)果 1株菌株對環(huán)丙沙星中介，3株為耐藥。2株菌株對左氧氟沙星敏感，1株中介，1株耐藥。4株菌株對青霉素類、頭孢類、酶抑制劑類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、磺胺類等常見抗菌藥物均敏感。見表1。

表1 4株腿傷克斯特菌的藥敏結(jié)果

3 討論

2003年，Coenye等[1]從下肢傷口、痰和糞便等臨床分泌物中首次發(fā)現(xiàn)了克斯特氏菌屬，同時(shí)，因?yàn)樵摼饕蛛x自下肢傷口，故將其命名為腿傷克斯特菌。腿傷克斯特菌鏡下為革蘭陰性球桿菌，其在血平板上菌落呈灰白色，麥康凱平板上菌落呈淺紫色，菌落均表面粗糙、扁平且遷徙生長，與文獻(xiàn)[7]描述一致。該菌過氧化氫酶、動(dòng)力試驗(yàn)陽性，氧化酶、硝酸鹽還原、尿素酶、氨基酸脫羧酶、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽利用、糖(醇、苷)類發(fā)酵、β-半乳糖苷酶及七葉苷水解試驗(yàn)陰性，在日常工作中依據(jù)其菌落形態(tài)及氧化酶陰性可初步鑒別。

由于腿傷克斯特菌與產(chǎn)堿桿菌科其他菌屬的生物特性相似，因此生物化學(xué)方法不易區(qū)分[11]。同時(shí)，MicroScan WalkAway、Vitek 2和API 20 NE等自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)也無法準(zhǔn)確地鑒定該菌，但文獻(xiàn)和本研究中，MALDI-TOF MS及測序技術(shù)均能準(zhǔn)確鑒定出該菌屬，有助于少見病原體的檢出[3]。隨著臨床實(shí)驗(yàn)室中MALDI-TOF MS的普及，腿傷克斯特菌被發(fā)現(xiàn)在各種臨床標(biāo)本中，如血液[6]、支氣管肺泡灌洗液[12]、尿液[13]、耳膿性分泌物[14]、下肢傷口分泌物[2]等，但在中國僅有1例相關(guān)報(bào)道[4]，可能與人員認(rèn)識(shí)能力、實(shí)驗(yàn)室條件等密切相關(guān)。

在本研究中，2名患者痰培養(yǎng)均分離出銅綠假單胞菌與腿傷克斯特菌，1名患者分離出肺炎克雷伯菌與腿傷克斯特菌，另一名患者分離出肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌與腿傷克斯特菌，提示腿傷克斯特菌感染的患者常呈混合感染，這與Ogawa等[13]發(fā)現(xiàn)相似，究其原因，可能該菌更易在有利于混合感染的條件下生長。同時(shí)，據(jù)報(bào)道，在免疫抑制患者中，常檢出無色桿菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬(與該菌相似)與其他細(xì)菌混合感染[13,15]。因?yàn)榇思?xì)菌常呈混合感染的特性，該菌在疾病的進(jìn)展過程中發(fā)揮的作用還不清楚，但在Bostwick等[6]研究中，患者嚴(yán)重的疾病、血培養(yǎng)單菌的檢出及依據(jù)藥敏結(jié)果應(yīng)用抗菌藥物治療后的臨床改善均提示腿傷克斯特菌是導(dǎo)致其疾病的主要原因。

藥敏結(jié)果顯示，4株腿傷克斯特菌對氟喹諾酮類抗菌藥物敏感、中介或耐藥，對其他常用抗菌藥物均敏感，這與Deutscher等[12]報(bào)道的基本一致，與Bostwick等[6]報(bào)道不同，可能與地域性、個(gè)體性差異等有關(guān)。微生物室應(yīng)及時(shí)對分離菌進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)以指導(dǎo)臨床合理用藥。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道腿傷克斯特菌SWMUKG01 含有氟喹諾酮、磺胺、利福平和磷霉素等耐藥基因以及外排泵系統(tǒng)[4]，提示某些腿傷克斯特菌可能為多重耐藥菌，應(yīng)引起臨床重視。

綜上所述，腿傷克斯特菌可能與某些疾病的感染相關(guān)。作為微生物檢驗(yàn)人員，應(yīng)增強(qiáng)對此菌的認(rèn)知，若多次在合格標(biāo)本中檢出該菌且鏡下有白細(xì)胞吞噬現(xiàn)象，應(yīng)高度懷疑與感染相關(guān)。同時(shí)，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)多借助MALDI-TOF MS及16S rDNA測序技術(shù)提高少見病原體的檢出率。