郭振華，邢廣旭，翁茂洋，金前躍，喬松林，張改平,2,3*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

自2018年8月非洲豬瘟(African swine fever，ASF)傳入我國以來，給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來了毀滅性的打擊，生豬和豬肉價(jià)格高峰時(shí)是我國往常年份正常價(jià)格的3倍左右[1-2]。盡管通過生物安全的全面提升和精準(zhǔn)剔除技術(shù)的應(yīng)用，我國生豬產(chǎn)能得到了一定的恢復(fù)，但ASF的存在與流行，依然使得我國生豬產(chǎn)業(yè)顯得相對(duì)脆弱。

ASF是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起豬的一種高度接觸性傳染性疾病，臨床上以急性、熱性、出血性、高發(fā)病率和高病死率為主要特征[3]。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬，為有囊膜的雙股DNA病毒，基因組大小為170～190 kb，編碼150～200個(gè)蛋白[4]。根據(jù)B646L基因序列，ASFV可以分為至少23個(gè)基因型，當(dāng)前在非洲以外地區(qū)(如中東歐、高加索和亞洲地區(qū))流行的主要是基因Ⅱ型[5]。已有的研究顯示，CD2v基因和MGF360/505基因簇是ASFV重要的毒力基因，通過兩者的敲除可以顯著降低ASFV的毒力，并且基因缺失株感染豬只后，可以對(duì)野毒株的攻擊顯示出一定的保護(hù)效果[1,6-7]。

早發(fā)現(xiàn)和早診斷對(duì)于ASF的防控至關(guān)重要，而熒光定量PCR檢測技術(shù)因其高特異性、高敏感性和良好的時(shí)效性，已廣泛應(yīng)用于ASFV的診斷檢測中[8]。但是ASF在我國流行2年多來，已經(jīng)出現(xiàn)了一些新的情況，如農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年3月8日發(fā)布了《關(guān)于進(jìn)一步嚴(yán)厲打擊ASF假疫苗有關(guān)違法行為的通知》，表明我國ASF田間流行毒株已呈現(xiàn)出一定程度的復(fù)雜化。因此，有必要建立針對(duì)野毒株和基因缺失株的鑒別診斷方法。本研究旨在建立一種針對(duì)B646L、CD2v和MGF505-2R基因的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法，為ASFV的臨床診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸豬繁殖與呼吸綜合征病毒HN07-1(KX766378)、偽狂犬病病毒HeNLH/2017(MT7-75883)、豬塞尼卡病毒HeNNY-1/2018(MK35-7116)、圓環(huán)病毒DF-1(JN119255)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。豬瘟弱毒疫苗、乙腦弱毒疫苗、流行性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎病毒二聯(lián)弱毒疫苗均購自武漢科前生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備與主要試劑熒光定量PCR儀(ABI 7500)，美國ABI公司產(chǎn)品；核酸濃度測定儀NanoDrop One，美國ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑(PrimeScriptTMRT Master Mix)和探針法熒光定量試劑盒(Premix Ex TaqTM)均購自TaKaRa公司。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)合成根據(jù)ASFV株P(guān)ig/HLJ/2018(MK333180)的基因組序列，通過Primer3Plus(http://www.primer3plus.com)和Primer express 3.0.1軟件針對(duì)B646L、MGF505-2R和CD2v基因進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。引物和探針均由生工生物(上海)股份有限公司合成(表1)，引物和探針用無菌水稀釋到10 μmol/L,于-20℃保存。

表1 引物和探針序列

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備B646L(1 941 bp)、MGF505-2R(1 581 bp)和CD2v(1 083 bp)基因委托生工生物(上海)股份有限公司直接合成到pUC57質(zhì)粒上作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,分別為pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v；質(zhì)粒濃度用NanoDrop One進(jìn)行測定，并進(jìn)一步換算為拷貝數(shù)，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。基因拷貝數(shù)計(jì)算公式如下：拷貝數(shù)(copies /mL)= [質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度(g/mL)/(質(zhì)粒DNA長度×660)]×6.02×1023。

1.5 敏感性及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制經(jīng)過引物和探針濃度的摸索，最終確定25 μL最佳反應(yīng)體系為Premix Ex Taq 12.5 μL，引物和探針在反應(yīng)體系中的終濃度為0.1 μmol/L，ROX Reference DyeⅡ0.25 μL，模板取5 μL，并用無菌水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為95℃ 20 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。為進(jìn)一步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按照1∶1∶1的體積比進(jìn)行混合，然后進(jìn)行10×倍比稀釋，在100～108拷貝數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，初步確定所建立方法檢測的敏感性；同時(shí)在循環(huán)次數(shù)(Ct值)15～30的范圍內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為x軸，以Ct值為y軸，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 最低檢測下限的確定根據(jù)敏感性檢測的結(jié)果，將混合的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做進(jìn)一步的稀釋，分別設(shè)101,0.5×101,100copies/μL 3個(gè)濃度，用建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法對(duì)每個(gè)濃度做12次重復(fù)檢測，以全部檢測陽性作為該方法針對(duì)基因的檢測下限。

1.7 特異性試驗(yàn)以PRRSV、PEDV、TGEV、JEV、CSFV、JEV和SVA的cDNA，PCV2和PRV的DNA，ASFV的DNA和標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v質(zhì)粒為模板，同時(shí)設(shè)立以純凈水為模板的陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以評(píng)估所建立檢測方法的特異性。

1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)選取102～107copies/μL 6個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別做3批重復(fù)檢測，每批次內(nèi)每個(gè)稀釋度均設(shè)3個(gè)重復(fù)，并計(jì)算批內(nèi)和批間的標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，以評(píng)估所建立檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.9 臨床核酸樣品檢測ASFV陽性樣品的核酸提取物由某養(yǎng)殖企業(yè)提供，為2020年6-12月間，對(duì)運(yùn)豬車表面殘留的糞便和血漬進(jìn)行常規(guī)采樣監(jiān)測而獲得，共計(jì)30份核酸提取物。用本研究建立的方法和OIE推薦的方法進(jìn)行平行檢測，比較兩者在臨床樣品檢測中的一致性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度測定經(jīng)測定換算，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最終濃度分別為2.6×108copies/μL(pUC57-B646L)、2.8×108copies/μL(pUC57-MGF505-2R)和3.2×108copies/μL(pUC57-CD2v)，經(jīng)10×倍比稀釋至100備用。

2.2 條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制在25 μL的反應(yīng)體系中，比較了引物和探針的終濃度分別為0.1,0.2和0.3 μmol/L時(shí)的擴(kuò)增效果。最終選擇的擴(kuò)增體系如下：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物和探針的終濃度為0.1 μmol/L，ROX Reference DyeⅡ0.25 μL，模板取5 μL，并用無菌水補(bǔ)足25 μL。使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System的最佳反應(yīng)程序：95℃ 20 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步在模板濃度為101～107copies/μL時(shí)，可以獲得良好的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。如圖1所示，B646L基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.214x+37.54，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為104.7%(圖1A)；MGF505-2R基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.314x+38.43，相關(guān)系數(shù)R2=1，擴(kuò)增效率為100.31%(圖1B)；CD2v基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.326x+39.82，相關(guān)系數(shù)R2=1，擴(kuò)增效率為99.85%(圖1C)。

A～C.pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的稀釋濃度分別為2.6×107～2.6×101，2.8×108～2.8×102和3.2×108～3.2×102 copies/μL

2.3 特異性試驗(yàn)以ASFV DNA和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的混合物為陽性對(duì)照，以PRRSV、PEDV、TGEV、JEV、CSFV、JEV和SVA的cDNA，PCV2和PRV的DNA為模板，以無菌水為陰性對(duì)照，用建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法進(jìn)行檢測，如圖2所示，陽性對(duì)照組可以出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線，而含有其他病原cDNA或者DNA的樣品檢測均為陰性，表明本研究建立的檢測方法具有良好的特異性。

圖2 三重?zé)晒舛縋CR特異性分析

2.4 敏感性試驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別做10×倍比稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)品濃度在101～108copies/μL之間，用設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測。如圖3所示，建立的熒光定量PCR檢測方法均可獲得良好的擴(kuò)增曲線。為進(jìn)一步確定最低檢測下限，進(jìn)一步設(shè)定101,0.5×101，100copies/μL 3個(gè)濃度，用建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法對(duì)每個(gè)濃度做12次重復(fù)檢測，以全部檢測結(jié)果為陽性作為該基因片段的檢測下限。結(jié)果見表2，針對(duì)B646L基因的檢測下限為6.5 copies/μL，針對(duì)MGF505-2R基因的檢測下限為8 copies/μL，針對(duì)CD2v基因的檢測下限為14 copies/μL。

表2 最低檢測限分析

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性檢測，結(jié)果如表3所示，當(dāng)模板濃度在102～107copies/μL之間時(shí)，對(duì)應(yīng)Ct值在15～30之間時(shí)，組內(nèi)變異系數(shù)為0.10%～1.17%,組間變異系數(shù)為0.05%～2.68%，表明建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表3 ASFV核酸三重?zé)晒舛縋CR檢測方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測針對(duì)30份ASFV陽性樣品的核酸提取物，分別用本研究建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法和OIE推薦的熒光定量檢測方法進(jìn)行平行檢測(表4)。結(jié)果顯示，建立的方法在檢測B646L基因時(shí)，與OIE的檢測結(jié)果具有良好的吻合性；此外，針對(duì)MGF505-2R和CD2v基因的檢測也均獲得了良好的擴(kuò)增曲線，在檢測的樣本中，未發(fā)現(xiàn)有基因缺失株。

表4 臨床樣品檢測結(jié)果 Ct 值

A～C.pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的稀釋濃度分別為2.6×108～2.6×101，2.8×108～2.8×101和3.2×108～3.2×101 copies/μL

3 討論

自2018年8月ASF在我國首次報(bào)道以來，已經(jīng)給我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11]。特別是2020年下半年以來，ASF在我國的流行出現(xiàn)了一些新的情況，如張艷艷等[12]報(bào)道了1株CD2v基因缺失株，SUN等[13]報(bào)道了CD2v基因自然變異導(dǎo)致吸附紅細(xì)胞功能喪失的弱毒株；此外，以CD2v和MGF360/505為代表的單基因或者雙基因缺失的假疫苗毒已經(jīng)成為新的傳染源和污染源[11]，使得我國ASF的流行情況更為復(fù)雜，這些均對(duì)我國生豬產(chǎn)業(yè)的復(fù)產(chǎn)和ASF的防控構(gòu)成了新的挑戰(zhàn)。

熒光定量PCR/RT-PCR檢測技術(shù)因其高特異性、高敏感性和快速高效的特點(diǎn)，是臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛的核酸診斷技術(shù)[9-10,14-16]。如任名等[17]和吳亞楠等[18]均建立了基于B646L基因的TaqMan熒光定量PCR檢測方法；吳映彤等[19]利用重組酶聚合酶擴(kuò)增等溫檢測技術(shù)建立了針對(duì)MGF360-12L基因的檢測方法，最低檢測限達(dá)到103copies/μL，與常規(guī)PCR方法檢測限相當(dāng)，但僅需35℃作用30 min，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的穩(wěn)定擴(kuò)增；王之瑩等[20]將PCR技術(shù)和膠體金試紙條技術(shù)相結(jié)合，基于B646L基因，開發(fā)了一種簡單、快速和低成本側(cè)流核酸測定試紙條，最低檢測限也和常規(guī)PCR相當(dāng)?？梢姰?dāng)前報(bào)道的以及OIE推薦的ASFV的核酸檢測技術(shù)主要是基于B646L基因來進(jìn)行開發(fā)的，無法對(duì)基因缺失毒株(如CD2v和MGF360/505)進(jìn)行鑒別診斷。

本研究中，我們?cè)谇捌贐646L和MGF505-2R基因雙重?zé)晒舛縋CR的基礎(chǔ)上[16]，針對(duì)CD2v基因設(shè)計(jì)了新的引物和探針，經(jīng)過引物、探針的篩選，確立了FAM(B646L)、VIC(MGF505-2R)和CY5(CD2v)熒光標(biāo)記的三重?zé)晒舛繖z測方法，且整個(gè)反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成。特異性分析顯示，該檢測方法與豬場常見的病毒核酸如PCV2、PRRSV、PRV、CSFV、JEV、PEDV和TGEV等均不發(fā)生交叉反應(yīng)；敏感性分析顯示，該檢測方法針對(duì)B646L、MGF505-2R和CD2v標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的最低檢測下限分別為6.5,8.0和14.0 copies/μL；且該方法在模板濃度為101～107copies/μL之間具有良好的線性擴(kuò)增關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，擴(kuò)增效率為99.85%～104.70%；穩(wěn)定性分析顯示，當(dāng)模板濃度為102～107copies/μL 時(shí)，組內(nèi)變異系數(shù)為0.10%～1.17%，組間變異系數(shù)為0.05%～2.68%，提示該方法重復(fù)性良好。進(jìn)一步針對(duì)運(yùn)豬車ASFV陽性樣品的核酸提取物檢測顯示，針對(duì)B646L的基因檢測結(jié)果和OIE推薦的檢測方法完全一致，且針對(duì)MGF505-2R和CD2v基因均出現(xiàn)了特異性的擴(kuò)增曲線。提示本研究中并未監(jiān)測到基因缺失株，也說明基因缺失株在臨床的流行率偏低，ASFV野毒株依然是當(dāng)前主要流行毒株。

綜上所述，本研究成功建立一種同時(shí)檢測ASFV B646L、CD2v和MGF505-2R基因的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法，該方法具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，從而為臨床ASFV的鑒別診斷提供了理論依據(jù)。